Выписка из ифнс бесплатно: Выписка из ЕГРЮЛ по ИНН

3.3.1. Культура трехмерных сфероидов

МСК могут расти в виде трехмерных (3D) агрегатов (сфероидов), где клетки прикрепляются друг к другу, а не к поверхности. Наиболее распространенным методом создания сфероидов является метод висящих капель, при котором маленькие капельки клеточной суспензии помещаются в статическую колбу для тканевых культур и культивируются в перевернутом виде над ванной с буферным раствором, таким как фосфатно-солевой буфер (PBS). Сфероиды также создавались спонтанно в пластинах с низким прикреплением, в системах на основе микролунок, таких как AggreWells, и в суспензионных биореакторах путем инокуляции клеток с высокой плотностью [77–79].По сравнению с традиционными двумерными адгезивными однослойными культурами, рост в виде трехмерных сфероидов считается более физиологически значимым [80]. Было показано, что МСК в трехмерных агрегатах проявляют повышенные противовоспалительные, ангиогенные и тканевые репаративные / регенеративные свойства [80]. Механофизические свойства сфероидов МСК кардинально различаются, с реорганизацией цитоскелета и изменениями в морфологии клеток, которые создают относительно меньшие клетки сферической формы. МСК, выращенные внутри сфероидов, также имеют значительные различия в экспрессии генов и улучшенных свойствах стволовых клеток (т.е., стволовость), включая улучшенный потенциал множественной дифференцировки [81].

Аналогичным образом было продемонстрировано, что КМ, полученные из культур сфероидных МСК, более эффективны, чем МСК, выращенные в виде монослоя, в подавлении воспалительного ответа в стимулированных макрофагах в совместном культивировании и на модели мышей [28, 82]. Этот эффект объясняется значительно более высокими уровнями экспрессии противовоспалительных факторов TSG-6, STC-1 и CXCR4 и повышенной секрецией PGE2 как основного медиатора воспаления.КМ из сфероидных МСК ингибирует секрецию макрофагами провоспалительных цитокинов TNF- α , CXCL2, IL-12p40 и IL-23 и увеличивает их секрецию противовоспалительных цитокинов IL-10 и IL-2R α . Другое исследование выявило значительное снижение индекса хемотаксии клеток CD14 ⁺ при инкубации с микровезикулами, полученными из 3D-сфероидов MSC, по сравнению с микровезикулами, полученными из 2D-MSC. Это предполагает, что режим культивирования МСК может влиять на иммуномодулирующие характеристики полученной популяции микровезикул [83].

МСК, культивируемые как трехмерные сфероиды, также проявляли повышенный уровень определенных белков и цитокинов с более чем чисто иммуномодулирующими эффектами, таких как антионкогенные белки IL-24, TNF- α , CD82, промотор васкулогенеза и ангиогенеза VEGF и белки, участвующие в дифференцировка и выживаемость клеток, таких как TGF- β 3 [82, 83]. Более того, МСК, выращенные в трехмерных сфероидах, совместно культивируемых с остеоартритическими хондроцитами, демонстрируют более высокий потенциал восстановления хряща по сравнению с таковыми, выращенными в виде двухмерного монослоя [84].Хотя существует ограниченное количество исследований влияния культуры сфероидов на многие аспекты секретома, можно было бы ожидать, что усиление межклеточного взаимодействия, изменение морфологии клеток и потенциально гипоксическая природа внутреннего микроокружения сфероида окажут большое влияние на состав полученного секретома МСК.

3.3.2. Гипоксия / аноксия

Большинство из культур in vitro подвергаются воздействию кислорода на уровне 21%. Поскольку МСК, как правило, не подвергаются воздействию таких высоких уровней кислорода в своей естественной среде, этот уровень кислорода можно рассматривать как гипероксический, состояние культивирования, которое, как сообщается, способствует окислительному стрессу и генетической нестабильности, приводящим к повреждению ДНК и сокращению продолжительности жизни [ 85].С другой стороны, аноксия, определяемая как уровень кислорода в свободном пространстве <1%, используется для моделирования условий ишемического повреждения in vitro . В то время как выживаемость МСК снижается с увеличением времени воздействия аноксии, недостаток кислорода может активировать высвобождение хемотаксических и ангиогенных медиаторов, имеющих решающее значение для регенерации и восстановления тканей [86]. Хотя это не обязательно напрямую отражает уровни кислорода, которым подвергаются клетки, кондиционирование МСК при концентрациях кислорода в свободном пространстве от 1 до 5%, часто называемых условиями гипоксического культивирования, используется как менее экстремальный метод, чем аноксия, для индукции активации. путей выживания и секреции продуктов, которые могут адаптировать клетки к стрессовой среде [24].Это привело к появлению популяций, которые демонстрируют повышенную кинетику роста, большую способность к дифференцировке и терапевтически желательные характеристики за счет активации индуцируемого гипоксией фактора- (HIF-) 1 α [87].

Сообщалось, что гипоксия усиливает как профиль секреции МСК, так и количество высвобождаемых экзосом [88–90]. Наблюдалась сверхэкспрессия miRNAs, участвующих в воспалительной, пролиферативной и дифференцировочной фазах, включая miR-223, -146b, -126, -199a, -11, -22, -24 и -210 [89, 91].Это согласуется с активацией факторов, участвующих в клеточной пролиферации, дифференцировке, выживании, ангиогенезе, иммуномодуляции и / или нейрорегуляции, включая VEGF, GM-CSF, IGF-1, IL-6, EGF, FGF, PDGF и GCSF [88 , 90, 92, 93]. Более того, исследований in vivo продемонстрировали усиленную регенерацию мышц и повышенный защитный эффект при остром поражении легких, вызванном эндотоксинами, при введении предварительно кондиционированных гипоксией ЭВ, полученных из МСК [89, 94].

Существуют некоторые расхождения между исследованиями в отношении усиления или подавления факторов, возникающих в результате различных концентраций кислорода, времени воздействия, источника клеток или среды культивирования.Паке и др. . [86] сообщил, что КМ из аноксических условий (0,1% O ₂ свободное пространство) обладает улучшенными хемотаксическими и проангиогенными свойствами, наряду с пониженным содержанием медиатора воспаления, в то время как он не показал существенных различий между гипоксическими (5% O ₂ свободным пространством). ) и нормоксических (21% O ₂ свободное пространство) условиях, в отличие от других исследований. Сообщалось, что TGF- β 1 активируется при концентрации в свободном пространстве 1% O ₂ [93], но снижается при 5% O ₂ [92].Hung et al. [93] также показали усиление остеогенных и адипогенных факторов, но снижение хондрогенных факторов, в отличие от нескольких исследований, которые продемонстрировали усиление хондрогенеза в индуцированных гипоксией МСК [95–97]. Ли и др. [94] продемонстрировали важность времени воздействия в исследовании, в котором они подвергали МСК воздействию гипоксической среды в течение 30, 60 или 90 минут с разными результирующими профилями секретома.

Секретом MSC очень динамичен, и существует явная потребность в точных отчетах при исследованиях давления кислорода.Хотя исследования сообщают о концентрации кислорода в воздухе, уровни растворенного кислорода, которым подвергаются клетки в культуре, могут различаться в зависимости от таких параметров, как глубина среды, плотность клеток и скорость потребления кислорода. Часто упускается из виду и время выдержки. Существуют различия между клетками, подвергшимися краткосрочному прекондиционированию гипоксией, и клетками, которые подверглись длительной экспансии в среде с низким содержанием кислорода. Сообщалось, что клетки, подвергшиеся гипоксии от пассажа 0 до пассажа 2, были способны к более быстрому размножению по сравнению с клетками, культивированными в нормоксии, и демонстрировали повышенную экспрессию генов, участвующих в сборке внеклеточного матрикса, нервном и мышечном развитии и развитии эпителия [98].Поскольку МСК демонстрируют измененные характеристики роста и экспрессию генов, вполне вероятно, что профиль секретома также будет изменен в таких обстоятельствах. Понятно, что условия гипоксии сильно влияют на терапевтические свойства МСК, но для правильного сравнения и воспроизведения результатов необходима стандартизация протоколов, связанных с гипоксией.

3.3.3. Mechanical Stimuli

МСК показали высокую механочувствительность [99]. Было показано, что на поведение клеток, такое как пролиферация и дифференцировка, а также на профиль их секретома, сильно влияют механические стимулы, такие как напряжение сдвига жидкости и сжатие [24, 100].МСК передают механические стимулы из окружающей их микросреды в биохимические сигналы посредством механотрансдукции [100]. Хотя большинство публикаций в этой области сосредоточено на механической стимуляции как средстве воздействия на клеточную дифференцировку [99, 101], становится все более очевидным, что паракринные факторы, генерируемые клетками, сильно зависят от их механической среды [16, 100, 102, 103]. Например, было обнаружено, что культивирование МСК на микроносителях в биореакторах с перемешиваемой суспензией, где клетки подвергаются воздействию сил сдвига жидкости, усиливает нейрорегуляторный профиль секретома, включая ряд регуляторов ЦНС, обнаруживаемых только в КМ МСК, культивируемых в биореакторе, а не в КМ клеток, выращенных в статических планшетах для тканевых культур [16].Классические трофические факторы BDNF, VEGF и IGF-1 также были активированы в культуре динамического биореактора [16]. Конструкции МСК, подвергнутые физиологической компрессии, имели усиленный ангиогенный профиль внутри КМ, который также был обогащен растворимыми регуляторами MMP-2, TGF- β 1 и bFGF [102]. Кроме того, воздействие на МСК многоосного сдвига и сжатия усиливало их хондрогенный профиль аналогично, но отчетливо, как тот, который вызывается стимуляцией TGF- β 1 [100]. Продукция оксида азота (NO) была значительно выше в нагруженных группах, при этом NO играл эффективную роль в иммуномодуляции МСК за счет подавления Т-клеточного ответа [100].

МСК также реагируют на механические свойства своей подложки (т.е. поверхности, на которой они прикреплены), включая жесткость [99]. Жесткость матрикса может направлять дифференцировку клеток в направлении определенных клонов [99], и, как таковые, изменения состояния клеток изменяют секретом [100]. VEGF, ангиогенин и IGF активируются с увеличением модулей упругости, тогда как уровни EGF, IL-6 и IL-8 не реагируют на изменение жесткости [103]. Очевидно, что механическая стимуляция играет важную роль в определении состава и функции секретома, и дальнейшие исследования должны изучить способы использования динамических культур и механических свойств субстратов клеточных культур.

3.3.4. Электромагнитные стимулы

Воздействие на МСК электромагнитных полей (ЭМП) — еще одна стратегия влияния на поведение клеток, когда клетки общаются друг с другом посредством отправки и получения электромагнитных сигналов [104]. В богатых коллагеном тканях, таких как кости и хрящи, при приложении механических нагрузок возникают небольшие эндогенные электрические поля [105]. Таким образом, большинство исследований с участием МСК в этой области на сегодняшний день сосредоточено на остеогенной и хондрогенной дифференцировке посредством стимуляции ЭМП [106].Например, воздействие ЭМП на MSCs Wharton, полученное из желе (1,8 мТл, 75 Гц, 8 ч / день в течение 21 дня), увеличивало деление клеток и плотность клеток, индуцировало раннюю хондрогенную дифференцировку и повышало уровни экспрессии коллагена II [107]. Точно так же, хотя и зависит от интенсивности, времени воздействия и частоты ЭМП, воздействие ЭМП использовалось для усиления остеогенной и нервной дифференцировки [108–110], воздействия на метаболизм и структуру клеток [111] и повышения жизнеспособности клеток [112].

Очень мало исследований было сосредоточено на влиянии ЭМП на секрецию МСК.Marędziak et al., . [113] сообщил, что в статическом магнитном поле (0,5 Тл) полученные из жировой ткани МСК секретируют значительно большее количество микровезикул по сравнению с контролем без магнитной стимуляции. Кроме того, микровезикулы, собранные из магнитно-стимулированных МСК, содержали большее количество BMP-2, VEGF и p53 и меньшее количество TNF-α . Таким образом, контроль воздействия ЭМП, наряду с механическими, электрическими и биохимическими стимулами, может предоставить значительную возможность для улучшения и оптимизации биопроцессов для продуктов, полученных из секретома МСК.

3.3.5. Биохимические стимулы

МСК также сильно зависят от прямых биохимических сигналов, вызываемых различными биомолекулами. Большая часть исследований с участием секретома МСК с точки зрения биохимической передачи сигналов основана на том факте, что стимулированные МСК высвобождают молекулы и ЭВ для противодействия таким биологическим сигналам и, таким образом, производят большее количество поддерживающих белков, миРНК, липидов и других метаболитов [114 ]. Один из способов вызвать провоспалительный стрессовый фенотип — это предварительное кондиционирование МСК липополисахаридом (ЛПС) [115, 116].В традиционных 2D однослойных культурах, по сравнению с контролем МСК, культивируемых без ЛПС, предварительное кондиционирование ЛПС индуцировало МСК с высвобождением провоспалительных цитокинов ИЛ-1 β , ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИФН и ФНО- α. , что, в свою очередь, снижает секрецию провоспалительных цитокинов из других типов клеток [115, 116]. Прекондиционированные LPS экзосомы, полученные из МСК, вводили в модель кожной раны крысам с индуцированным стрептозотоцином диабетом и были способны повышать экспрессию противовоспалительных цитокинов и способствовать активации макрофагов M2 [115].У частично гепатэктомированных мышей внутривенное введение CM из LPS-прекондиционированных MSC снижает секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF- α и усиливает регенерацию печени [116].

МСК также продуцируют иммуномодулирующие и регенеративные факторы в ответ на воспалительные стимулы, такие как гамма-интерферон (IFN- γ ) и TNF- α . Было показано, что воздействие IFN- γ усиливает иммуносупрессивные свойства МСК за счет усиления или индукции факторов ингибирования МСК, подавления активации Т-клеток, усиления негативной передачи сигналов Т-клеток, изменения Т-клеток с провоспалительного на противовоспалительный фенотип, взаимодействия с антигеном. -представляющие клетки и увеличивающие или индуцирующие регуляторные клетки [117].Однако было показано, что IFN- γ сам по себе не вызывает иммуносупрессии, и только в сочетании с TNF- α , IL-1 α или IL-1 β иммуносупрессия с помощью МСК происходит. подавляют пролиферацию Т-клеток [118]. С любой из этих комбинаций МСК продуцировали несколько хемокинов, включая CXCL-9 и CXCL-10 в больших количествах [118]. Кроме того, для МСК, обработанных как IFN- γ , так и TNF- α , уровни секреции IL-6, HGF, VEGF и TGF- β были значительно увеличены, а уровни секреции при комбинации два были значительно выше, чем у IFN- γ или TNF- α отдельно [119].С другой стороны, экзосомы, предварительно кондиционированные TNF- α , способствовали пролиферации и остеогенной дифференцировке первичных остеобластических клеток человека [120].

Перекись водорода (H ₂ O ₂ ) может быть использована для создания микроокружения, имитирующего ишемию. Хотя высокие концентрации H ₂ O ₂ могут вызывать гибель или повреждение клеток, низкие концентрации могут запускать процессы, обеспечивающие защитные эффекты от стрессовых состояний.Было показано, что стимуляция H ₂ O ₂ увеличивает экспрессию проангиогенных белков, таких как VEGF и HGF [121], а также секрецию IL-6 [122]. Bai et al. продемонстрировали, что МСК, стимулированные H ₂ O ₂ , усиливали их ангиогенный эффект на HUVEC и увеличивали выживаемость кожного лоскута в модели in vivo [121].

Трансформирующий фактор роста — (TGF-) β 1 связан с клеточной пролиферацией, дифференцировкой, а также противовоспалительным и противовоспалительным действием.Воздействие TGF- β 1 модулирует секрецию МСК, изменяя секрецию цитокинов и хемокинов (перечисленных в таблице 2), участвующих в иммуносупрессии, аллергическом ответе и резорбции костей [123]. Такие исследования предоставляют доказательства того, что секретом может модулироваться биохимическими факторами, но все еще необходимо провести значительный объем исследований, чтобы оценить, как время воздействия и доза биохимической стимуляции влияют на результирующий профиль паракринного фактора для МСК.

3.4. Изоляция

Выделение продуктов, полученных из секретома МСК, является важным фактором при разработке биопроцессов из-за высокодинамичной природы секретома.Тип и количество секретируемых продуктов зависят от периода культивирования или фазы роста культуры, из которой выделяется секретом. Также необходимо учитывать метод выделения конкретных продуктов, в первую очередь электромобилей в среде. Как недавно было рассмотрено Ли и др. , существует множество проблем с современными методами изоляции ЭМ. [124] и Gholizadeh et al. [125]. Ультрацентрифугирование, хотя и способное работать с относительно большими объемами, и в настоящее время считается золотым стандартом для разделения этих структур, обеспечивает только степень извлечения до 25% и является длительным и сложным процессом [126].Есть также свидетельства того, что задействованные высокие силы (обычно 100 000) могут влиять на биоактивность самих электромобилей [127]. Механизмы исключения по размеру и захвата на основе антител ограничены низкой пропускной способностью и необходимостью заключительного этапа концентрирования [128]. Кроме того, использование механизмов на основе антител ограничено во многих приложениях из-за высокой стоимости. Микрогидравлические подходы позволяют одновременно изолировать и охарактеризовать электромобили, но восстановление электромобилей с таких устройств остается сложной задачей [125].Совсем недавно анионообменная хроматография была использована для выделения EV в одну стадию с высокой чистотой, которая использует отрицательный заряд EV [129]. Существует большая потребность в технологиях изоляции EV, которые обеспечивают высокую пропускную способность, поддерживают целостность и биоактивность EV и не являются чрезмерно дорогостоящими для клинических приложений. Будет важно использовать внутренние свойства электромобилей для разработки экономичных методов изоляции в будущем.

3.5. Хранение

При хранении и транспортировке продуктов, полученных из секретома MSC, важно учитывать эффекты замораживания-оттаивания, стабильность при различных температурах и эффекты лиофилизированных компонентов.Сообщается, что КМ можно хранить при -20 ° C в течение нескольких месяцев без ухудшения функций [130]. Для электромобилей было показано, что замораживание-оттаивание не влияет на размер экзосом и не нарушает целостность мембран, но уменьшение размера происходит на 60% через 2 дня при физиологической температуре 37 ° C, а также уменьшение через 3 дня. –4 дня при 4 ° C [131]. При замораживании при -20 ° C экзосомы стабильны в течение 6 месяцев без потери их биохимической активности [9]. Однако исследование Чжоу и др. . [132] продемонстрировал, что ингибиторы протеаз необходимы для надлежащего хранения, и замораживание экзосом мочи при -20 ° C приводит к большим потерям, в то время как замораживание при -80 ° C позволяет почти полностью выздороветь после 7 месяцев хранения. Кроме того, интенсивное встряхивание (т.е. 90 секунд) позволило максимально восстановить размороженные образцы экзосом. Эти исследования демонстрируют, что экзосомы могут подвергаться длительному хранению с высокой степенью извлечения без потери биоактивности. По сравнению с клетками, которые проявляют нарушенные терапевтические свойства в результате замораживания-оттаивания и требуют использования консервантов для надлежащего криохранилища, продукты, полученные из секретома, более поддаются хранению, что является ключевым моментом с точки зрения трансляции [53].

3,6. Доставка

Доставка продуктов, полученных из секретома, in vivo имеет те же ограничения, что и клеточная терапия. В большинстве исследований используется простая внутривенная инъекция питательной среды или ЭВ в PBS в место повреждения. Несмотря на способность экзосом проникать в ткани-мишени, задержка в этих областях ограничена, и для эффективного лечения необходимо выполнять повторные инъекции [133]. В одной публикации описывается использование фотоиндуцированного имин-перекрестно-сшивающего гидрогеля, который может быть встроен в экзосомы и использоваться в качестве тканевого пластыря из гидрогеля [133].Клетки смогли мигрировать в гидрогель и интернализовать инкапсулированные экзосомы. Gangadaran et al. [134] также продемонстрировали повышенное удержание EV в месте повреждения при смешивании и инъекции с каркасом Matrigel. Такая система предотвращает миграцию продуктов клеточного происхождения, таких как экзосомы, из целевого сайта и обеспечивает лучшую интеграцию для восстановления тканей. В зависимости от применения таких терапевтических средств, полученных из клеток, гидрогелевые системы могут обеспечивать более эффективное лечение за счет медленного высвобождения продуктов для предотвращения быстрого очищения участков или преждевременной деградации.

MSC, также были успешно доставлены посредством интеграции в тканевую кость [135] и в хирургическую сетку из фибрина [136]. Экзосомы добавляли для улучшения заживления и для стимулирования миграции клеток в каркасы. В то время как основные цели этих исследований состояли в том, чтобы улучшить результаты таких конструкций, успех интеграции и удержания EV предлагает дополнительную перспективу для использования бесклеточных терапевтических средств.

4. Выводы

В недавних сообщениях, объясняющих основные терапевтические преимущества МСК их паракринными эффектами, секретом и составляющие его экзосомы могут представлять собой новый и более безопасный подход к лечению заболеваний по сравнению с прямой клеточной терапией.Тот факт, что секретом и его компоненты неживые, будет способствовать разработке терапевтических стратегий, которые могут обеспечить более высокую стерильность, более низкий иммунный ответ и простоту транспортировки и хранения. Понимание того, как источник клеток, среда и условия культивирования взаимодействуют для определения количества, качества и типов секретируемых биомолекул, необходимо для разработки биопроцессов, направленных на увеличение производства продуктов, полученных из секретома. Кроме того, стандартизация протоколов выделения, характеристики, хранения и доставки необходима для надлежащего сравнения исследований и обеспечения эффективного контроля качества.

Сокращения

Конфликты интересов

В соответствии с лицензионным соглашением между Stemcell Technologies Inc. и доктором Унгрином / Университетом Торонто, доктор Унгрин имеет право на долю роялти от продаж технологии AggreWell. Это никоим образом не повлияло на нейтралитет или объективность этой статьи и не влияет на приверженность авторов политике журнала в отношении обмена данными и материалами.

Клонирование стимулированного интерфероном гена 17: промотор и ядерные белки, регулирующие транскрипцию | Молекулярная эндокринология

Аннотация

Член семейства интерферон-стимулированных генов (ISG) кодирует 17-кДа гомолог убиквитина, называемый ISG17, который индуцируется в эндометрии матки крупного рогатого скота с помощью интерферона-τ (IFN-τ) на ранних сроках беременности.КДНК ISG17 крупного рогатого скота (b) имеет 30% идентичности с тандемным убиквитиновым повтором и 70% идентичности с ISG15 человека (h). Настоящие эксперименты были разработаны для секвенирования гена bISG17, сравнения общей структуры с геном hISG15 и для идентификации факторов транскрипции, которые индуцировались IFN-τ в клетках эндометрия крупного рогатого скота (BEND). Промотор гена bISG17 был подобен гену hISG15 в размещении тандемного IFN-стимулирующего ответного элемента (ISRE) в положении -90, но уникален в присутствии трех дополнительных ISRE в положениях -123, -332 и -525. .IFN-τ (25 нм) индуцировал ядерные белки в клетках BEND, которые взаимодействовали с тандемным ISRE bISG17 в анализе сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). IFN-регуляторный фактор-1 (IRF-1), связанный с этим ISRE, основан на сверхсдвигающем EMSA с использованием антисыворотки против IRF-1. IFN-τ активировал STAT-1 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции-1) и -2 через 0,5 ч, а IRF-1 через 2 ч в клетках BEND. Сделан вывод, что ген bISG17 подобен гену hISG15, сохраняет ISRE, который взаимодействует с IRF-1, и, возможно, сначала индуцируется STAT, а затем IRF-1 в ответ на IFN-τ на ранних сроках беременности.

Введение

Литический эффект простагландина F ₂ α (PGF) необходимо избегать на ранних сроках беременности (1). В противном случае желтое тело регрессирует в ответ на снижение PGF и прогестерона, что приводит к ранней эмбриональной смертности. У жвачных животных беременность наступает благодаря действию интерферона-τ (IFN-τ) на эндометрий (1–3). IFN-τ высвобождается расширяющейся бластоцистой, связывается с рецептором эндометрия и изменяет характер секреции PGF маткой.Это приводит к спасению желтого тела и продолжению выработки прогестерона. Поскольку IFN-τ косвенно блокирует литическое действие PGF на желтое тело, его назвали «антилютеолизином». Антилютеолитический механизм действия IFN-τ (1, 2) включает ингибирование рецепторов эстрадиола, снижение рецептора окситоцина, активацию ингибитора циклооксигеназы и сдвиг PG в пользу PGE ₂ , лютеотропина, по сравнению с PGF, лютеолизин.

Помимо регуляции высвобождения PGF, IFN-τ индуцирует несколько белков матки (2, 4, 5).Функция этих белков на ранних сроках беременности остается неуловимой, за исключением гомолога бычьего убиквитина массой 17 кДа. Этот белок первоначально назывался перекрестно-реактивным белком убиквитина, или UCRP, потому что он имел общие эпитопы с убиквитином и перекрестно реагировал с антисывороткой против убиквитина при вестерн-блоттинге (6).

Конъюгация убиквитина с белками осуществляется за счет изопептидной связи между карбоксилглицином убиквитина и первичными аминами на целевых белках (7, 8).Белки, конъюгированные с убиквитином, процессируются посредством АТФ-зависимого мультикаталитического пути 26 S протеасомы, в котором целевые белки разрушаются, а убиквитин рециклируется (9). Гипотеза о том, что бычий (b) UCRP конъюгирован с белками эндометрия, была недавно проверена (10). Было продемонстрировано, что конъюгация UCRP отличается от конъюгации убиквитина с белками эндометрия (10). Кроме того, конъюгация bUCRP с белками эндометрия была вызвана беременностью и IFN-τ, тогда как конъюгация убиквитина с белками эндометрия — нет.

Клонирование кДНК bUCRP и анализ предполагаемой аминокислотной последовательности выявили 70% идентичности с человеческим членом семейства IFN-стимулированных генов (ISG), который кодирует белок массой 15 кДа (ISG15), и 30% идентичности с тандемом бычий убиквитиновый повтор (11). И IFN-α, и IFN-τ индуцировали мРНК и белок bUCRP в клетках эндометрия крупного рогатого скота (6, 12, 13). Поскольку ген bUCRP принадлежит к семейству ISG и кодирует белок массой 17 кДа, мы переименовали белок ISG17 в соответствии с номенклатурой, разработанной для человеческих ISG15 (14) и ISG54 (15).

IFN — это иммуномодулирующие белки, которые обладают различными клеточными эффектами в зависимости от клеточного происхождения и стадии дифференцировки (16). IFNs связываются с трансмембранными рецепторами, активируют янус-киназу (Jak) или тирозинкиназу (Tyk) и стимулируют быструю активацию экспрессии генов (17). Сигнальные преобразователи и активаторы транскрипции (STAT) представляют собой цитоплазматические факторы транскрипции, которые фосфорилируются Jaks и взаимодействуют как гетеро- или гомодимеры, регулируя транскрипцию генов. Было высказано предположение, что STAT опосредуют ранние геномные ответы на IFN (17).IFN-регуляторный фактор-1 (IRF-1), фактор транскрипции, индуцируется STAT, фосфорилируется и может опосредовать дистальные ответы на IFN (18).

Ген bISG17 можно использовать для исследования передачи сигнала в эндометрии в ответ на IFN-τ (13). bISG17 значительно отличается по обработке и первичной структуре по сравнению с hISG15. Еще одно важное различие между hISG15 и bISG17 — очевидная широко распространенная экспрессия hISG15 в нескольких клеточных линиях и тканях (19). Нозерн-блоттинг показал, что экспрессия гена bISG17 ограничена эндометрием беременных коров или эндометрием небеременных коров, которые лечили in vitro рекомбинантным бычьим (rb) IFN-τ или rbIFN-α (12).Хотя роль hISG15 может быть общей для многих типов клеток, транскрипция гена bISG17, по-видимому, является специфическим ответом на IFN-τ в эндометрии матки на ранних сроках беременности у коровы (12). Таким образом, цели настоящих экспериментов состояли в том, чтобы выделить и секвенировать ген bISG17, сравнить структуру и организацию с геном hISG15 и определить, индуцируются ли факторы транскрипции STAT-1, STAT-2, IRF-1 и IRF-2 под действием IFN-τ и участвует в регуляции гена bISG17.

Результаты

Саузерн-блот анализ

ДНК тимуса теленка расщепляли эндонуклеазами рестрикции и проводили блоттинг по Саузерну с использованием кДНК bISG17 (11) в качестве зонда.Расщепление геномной ДНК ферментами, которые не расщепляют кДНК, привело к образованию одной основной полосы гибридизации с другими второстепенными полосами гибридизации (рис. 1А). Основная гибридизирующая полоса в основном исчезла после переваривания геномной ДНК с помощью Pst I, Sma I и Sac I, которые, как известно, расщепляют кДНК bISG17 (11). Поскольку после переваривания с Sac I появились две более короткие полосы гибридизации, данные интерпретируются как означающие, что существует единственный главный ген, кодирующий bISG17.Фрагменты Sac I имели размер приблизительно 3,4 и 2,0 т.п.н. Даже в условиях нестрогой гибридизации (, т.е. 37 ° C), зонд кДНК bISG17 не гибридизировался с геномной ДНК человека, которая была расщеплена и подвергнута Саузерн-блоттингу, как описано для геномной ДНК крупного рогатого скота (не показано).

Рис. 1.

Идентификация гена bISG17 в геномной ДНК крупного рогатого скота (A) и в очищенном фаге (B) с использованием саузерн-блоттинга и зонда кДНК bISG17 На панели A стрелки указывают продукты расщепления с использованием Sac I, который, как известно, расщепляет кДНК.На панели B полоса 1 представляет окрашивание бромистым этидием фага, расщепленного Sac I, который содержит ген bISG17. Дорожка 2 представляет собой Саузерн-блоттинг фага, расщепленного Sac I, с использованием кДНК bISG17 в качестве зонда. Фрагменты гена bISG17, субклонированные в pBluescript SK, обозначены как pDP7 и pDP8.

Рис. 1.

Идентификация гена bISG17 в геномной ДНК крупного рогатого скота (A) и в очищенном фаге (B) с использованием саузерн-блоттинга и зонда кДНК bISG17 На панели A стрелки указывают продукты расщепления с использованием Sac I. , который, как известно, расщепляет кДНК.На панели B полоса 1 представляет окрашивание бромистым этидием фага, расщепленного Sac I, который содержит ген bISG17. Дорожка 2 представляет собой Саузерн-блоттинг фага, расщепленного Sac I, с использованием кДНК bISG17 в качестве зонда. Фрагменты гена bISG17, субклонированные в pBluescript SK, обозначены как pDP7 и pDP8.

Выделение геномного клона bISG17

Отдельный фаг был выделен и очищен после скрининга 1 × 10 ⁶ бляшек из геномной библиотеки крупного рогатого скота.Фаг, содержащий вставку размером 16 т.п.н., расщепляли Sac I и проводили блоттинг по Саузерну с использованием радиоактивно меченного кДНК-зонда bISG17. Два фрагмента Sac I гибридизировались с зондом кДНК bISG17 (рис. 1В). Эти фрагменты имели длину 3,4 и 2 т.п.н. и идентичны по размеру с фрагментами, идентифицированными на геномных саузерн-блотах после переваривания Sac I. Фрагменты Sac I очищали в геле, субклонировали в pBluescript SK ^— и называли pDP7 (3,4 т.п.н. ) и pDP8 (2,0 кб).

Первоначальное секвенирование со стандартными праймерами показало, что промотор и большинство кодирующих последовательностей содержатся в pDP8.Следовательно, эту плазмиду использовали для создания вложенных делеций путем частичного переваривания экзонуклеазой III и полностью секвенировали. Все последовательности были подтверждены перекрывающимися клонами и, при необходимости, с использованием внутренних праймеров. 3′-конец кодирующей последовательности и нижележащие некодирующие последовательности секвенировали из плазмиды pDP7 с использованием стандартных праймеров.

Последовательность гена bISG17 и его промотора, включая 1180 п.н. перед сайтом старта транскрипции, показана на рис.2. Регистрационный номер GenBank — AF069133. Ген содержит предполагаемый элемент TATA-бокса (TATTAAA) в положении -29 относительно кэп-сайта мРНК и возможный перевернутый элемент CAAT-бокса в положении -130. За сайтом кэпа мРНК следуют 5′-некодирующие последовательности и инициирующий кодон. Сразу после инициирующего кодона находится интрон длиной 437 п.н., за которым следуют оставшиеся кодирующие последовательности и 3′-нетранслируемые последовательности, которые были идентичны таковым, описанным для кДНК bISG17 (11).

Фиг.2.

и выведенная аминокислотная последовательность гена bISG17 (A), сравнение с промотором hISG15 (B) и идентификация кэп-сайта мРНК (C). Фрагменты гена bISG17 (pDP7 и pDP8) были клонированы в pBluescript SK ^— и секвенированный. Кодирующие белки последовательности обозначены прописными буквами . ISRE выделены жирным шрифтом , выделены полужирным шрифтом . Предполагаемый блок ТАТА, инвертированный элемент СААТ и сигнал полиаденилирования — подчеркнуты . Потенциальный мотив CREB — , выделенный жирным курсивом , а мотивы GAAANN — жирным шрифтом .Нумерация относится к сайту начала транскрипции РНК, обозначенному курсивом g в рамке, g . Панель B показывает гомологию нуклеотидных последовательностей между промоторами bISG17 и hISG15. Две нуклеотидные последовательности выровнены от -140 гена bISG17 до первых 17 нуклеотидов интрона. Идентичность нуклеотидов обозначена вертикальными линиями . Стрелки под последовательности ISG15 указывают вставки относительно последовательности ISG17. Тандемные ISRE и вышестоящие ISRE обозначены жирным подчеркнутым шрифтом .Предполагаемый элемент CREB выделен полужирным шрифтом и курсивом . Сайт кэпа мРНК обозначен жирным курсивом g , а начало трансляции обозначено заглавными буквами . Панель C показывает анализ удлинения праймера кэп-сайта мРНК bISG17. Нуклеотидная последовательность гена bISG17 с использованием праймера показана с нуклеотидами, обозначенными как G, A, T и C. Показаны более длинный (L) и более короткий (S) способы гибридизации. РНК эндометрия небеременных (NP) или беременных (P) коров использовали в качестве матрицы.Нуклеотидная последовательность, кодирующая кэп-сайт, показана ниже геля. Возможные участки заглушки показаны более короткими стрелками . Сайт, обозначенный как положение +1 в последовательности, обозначен самой длинной стрелкой , потому что это всегда был самый темный сигнал с использованием L-метода и соответствовал одному из сайтов, идентифицированных с помощью S-метода.

Рис. 2.

Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность гена bISG17 (A), сравнение с промотором hISG15 (B) и идентификация участка кепки мРНК (C) Фрагменты гена bISG17 (pDP7 и pDP8) ) были клонированы в pBluescript SK ^— и секвенированы.Кодирующие белки последовательности обозначены прописными буквами . ISRE выделены жирным шрифтом , выделены полужирным шрифтом . Предполагаемый блок ТАТА, инвертированный элемент СААТ и сигнал полиаденилирования — подчеркнуты . Потенциальный мотив CREB — , выделенный жирным курсивом , а мотивы GAAANN — жирным шрифтом . Нумерация относится к сайту начала транскрипции РНК, обозначенному курсивом g в рамке, g . Панель B показывает гомологию нуклеотидных последовательностей между промоторами bISG17 и hISG15.Две нуклеотидные последовательности выровнены от -140 гена bISG17 до первых 17 нуклеотидов интрона. Идентичность нуклеотидов обозначена вертикальными линиями . Стрелки под последовательности ISG15 указывают вставки относительно последовательности ISG17. Тандемные ISRE и вышестоящие ISRE обозначены жирным подчеркнутым шрифтом . Предполагаемый элемент CREB выделен полужирным шрифтом и курсивом . Сайт кэпа мРНК обозначен жирным курсивом g , а начало трансляции обозначено заглавными буквами .Панель C показывает анализ удлинения праймера кэп-сайта мРНК bISG17. Нуклеотидная последовательность гена bISG17 с использованием праймера показана с нуклеотидами, обозначенными как G, A, T и C. Показаны более длинный (L) и более короткий (S) способы гибридизации. РНК эндометрия небеременных (NP) или беременных (P) коров использовали в качестве матрицы. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кэп-сайт, показана ниже геля. Возможные участки заглушки показаны более короткими стрелками . Сайт, обозначенный как положение +1 в последовательности, обозначен самой длинной стрелкой , потому что это всегда был самый темный сигнал с использованием L-метода и соответствовал одному из сайтов, идентифицированных с помощью S-метода.

Промотор содержит пять предполагаемых IFN-стимулирующих ответных элементов (ISRE) в положениях от −525 до −513, от −332 до −320, от −123 до −111 и пару тандемных, перекрывающихся ISRE в положениях от −92 до −74. (Рис.2, А и Б). Мотив последовательности GAAANN, который обнаружен в промоторах генов IFN-α _, и IFN-τ (20), обнаруживается не менее 17 раз в обеих ориентациях в области от -170 до -1060. , CREB-подобная последовательность находится в положениях от -48 до -41. Общая структура кодирующих областей аналогична генам bISG17 и hISG15 (14) с интроном сразу после кодона инициации.Кодирующие области имели 68% идентичность последовательностей, как сообщалось ранее (11). Оба гена сохраняли тандемный перекрывающийся ISRE примерно на 50 п.н. выше ТАТА-бокса (рис. 2В). Ген hISG15 был секвенирован в положение -125 (фиг. 2B), тогда как ген bISG17 был секвенирован в положение -1180 (фиг. 2A).

Определение сайта начала транскрипции

Сайт кэпа мРНК для гена bISG17 определяли с помощью анализа удлинения праймера общей РНК эндометрия, выделенной от коров на 18 день беременности (рис.2С). Суммарная РНК эндометрия коровы на 18 день эстрального цикла служила контролем. Был выбран олигонуклеотидный праймер для гибридизации с мРНК в положении, которое находилось на 15 п.н. выше кодона инициации ATG на основе последовательности кДНК bISG17 (11). Наращивание праймера было выполнено двумя способами. В условиях длительной гибридизации с высоким содержанием соли были получены два основных сайта старта транскрипции. Более короткие условия гибридизации с низким содержанием соли дали четыре основных стартовых сайта. Использование второго олигонуклеотидного праймера (GCCAGGCTCTCTGCAGACAC), заканчивающегося на 36 п.н. выше инициирующего кодона, подтвердило эти результаты (не показаны).Хотя эти результаты могут представлять несколько сайтов начала транскрипции, первый нуклеотид G в серии был обозначен как положение 1, потому что соответствующая полоса является самой темной в длинном эксперименте по гибридизации. Ни одним из методов не было обнаружено транскриптов в общей РНК из эндометрия, собранной на 18 день эстрального цикла.

Emsa

Тандемный ISRE в гене bISG17 практически идентичен тандемному ISRE гена hISG15 (14).Между двумя последовательностями различается только один нуклеотид: замена G на A в вариабельной части консенсусной последовательности hISRE (рис. 2B). Тандемный ISRE bISG17 был синтезирован, мечен радиоактивным изотопом и использован в качестве зонда в EMSA с использованием ядерных экстрактов из обработанных IFN клеток эндометрия крупного рогатого скота (BEND).

Радиоактивно меченый олигонуклеотид, инкубированный в отсутствие ядерных экстрактов, имел самую быструю электрофоретическую подвижность (фиг. 3A). Конститутивное взаимодействие ISRE с ядерными экстрактами было отмечено как в контрольных, так и в обработанных IFN клетках BEND.В течение 2-часового периода эта более быстро мигрирующая составляющая полоса активировалась после инкубации с IFN-α или IFN-τ. Ядерные экстракты из клеток, обработанных IFN-α или IFN-τ в течение 2 часов, также имели одну уникальную более медленную полосу миграции, которая не была обнаружена в контроле. На уровне чувствительности этого анализа не было никакой разницы в ядерных белках, которые были связаны с энхансером ISRE в ответ на два протестированных IFN.

Рис. 3.

EMSA ядерных экстрактов из контрольных и обработанных IFN клеток BEND (панель A) и конкуренция с немеченым ISRE (панель B). Ядерные экстракты выделяли из клеток BEND, обработанных 0 (C) или 25 нМ IFN- α (A) или IFN-τ (T), как указано.Пять микрограммов экстракта инкубировали с 20000 имп / мин меченого олигонуклеотида ISRE (GGGAAAAGGAAACCGAAACT), разделяли на неденатурирующем 6% акриламидном геле и подвергали авторадиографии. Жирная стрелка отмечает миграцию свободного олигонуклеотида. Более светлая стрелка указывает смещенную полосу, появившуюся после обработки IFN. На панели B EMSA была завершена с использованием ядерных экстрактов, собранных после 1 или 2 ч культивирования с 25 нМ rbIFN-τ. Ядерные экстракты инкубировали с радиоактивно меченным ISRE в отсутствие или в присутствии 1-, 10- или 100-кратного молярного избытка немеченого ISRE.

Рис. 3.

EMSA ядерных экстрактов из контрольных и обработанных IFN клеток BEND (панель A) и конкуренция с немеченым ISRE (панель B) Ядерные экстракты были выделены из клеток BEND, обработанных 0 (C) или 25 нМ IFN. -α (A) или IFN-τ (T), как указано. Пять микрограммов экстракта инкубировали с 20000 имп / мин меченого олигонуклеотида ISRE (GGGAAAAGGAAACCGAAACT), разделяли на неденатурирующем 6% акриламидном геле и подвергали авторадиографии. Жирная стрелка отмечает миграцию свободного олигонуклеотида.Более светлая стрелка указывает смещенную полосу, появившуюся после обработки IFN. На панели B EMSA была завершена с использованием ядерных экстрактов, собранных после 1 или 2 ч культивирования с 25 нМ rbIFN-τ. Ядерные экстракты инкубировали с радиоактивно меченным ISRE в отсутствие или в присутствии 1-, 10- или 100-кратного молярного избытка немеченого ISRE.

Взаимодействие радиоактивно меченного ISRE с ядерными экстрактами клеток BEND, индуцированное IFN-τ, было специфическим, как показано на фиг. 3B. Коинкубация с 10- и 100-кратным молярным избытком холодного ISRE эффективно блокировала связывание ядерных белков с радиоактивно меченным ISRE, о чем свидетельствует исчезновение как более быстро мигрирующей составляющей полосы, так и более медленной мигрирующей полосы, которая индуцировалась IFN.

Вестерн-блоттинг STAT и IRF-1

Ядерные экстракты собирали несколько раз после обработки клеток BEND 25 нм rbIFN-τ или rbIFN-α и вестерн-блоттинга с использованием антител против STAT-1, STAT-2 и IRF-1. В этих экспериментах предполагалось, что транслокация этих факторов транскрипции в ядро ​​требует фосфорилирования и что обнаружение в ядре представляет активацию этих факторов транскрипции. Репрезентативные вестерн-блоты, показывающие обнаружение STAT-1, STAT-2 и IRF-1 в клетках BEND, можно найти на рис.4А. Количественное определение этих блотов выявило, что оба IFN активировали STAT-1 (фиг. 4B) и STAT-2 (фиг. 4C) в клетках BEND в течение 0,5 часа и IRF-1 в течение 2 часов (фиг. 4D). Для индукции IRF-1 требовалось более длительное время инкубации (2 ч) с IFN по сравнению с индукцией STAT. Более чем один ядерный белок иммунореагировал с антисывороткой против IRF-1.

Рис. 4.

Обнаружение STAT-1 (91 и 84 кДа), STAT-2 (113 кДа) и IRF-1 (37 кДа) в экстрактах ядер клеток BEND с использованием вестерн-блоттинга. соответствующий 37 кДа форме IRF-1 показан стрелкой .Клетки BEND инкубировали в течение 0, 0,5 или 2 ч в отсутствие (C) или в присутствии 25 нм rbIFN-α (A) или rbIFN-τ (T). Ядерные экстракты выделяли, разделяли (4 мкг) на SDS-полиакриламидных (7,5%) гелях, переносили на нитроцеллюлозу и детектировали с помощью антисывороток против STAT-1, STAT-2 или IRF-1. Вестерн-блоты количественно оценивали с помощью денситометрии. Оптическую плотность анализировали с помощью защищенного t -теста. Панели B, C и D показывают количественное определение STAT-1, STAT-2 и IRF-1 соответственно. Все средства обработки представляют собой повторные или трехкратные определения.Средние, обозначенные звездочкой , отличаются от контрольных ( P <0,05).

Рис. 4.

Обнаружение STAT-1 (91 и 84 кДа), STAT-2 (113 кДа) и IRF-1 (37 кДа) в ядерных экстрактах клеток BEND с помощью вестерн-блоттинга. полоса, соответствующая 37 кДа форме IRF-1, показана стрелкой . Клетки BEND инкубировали в течение 0, 0,5 или 2 ч в отсутствие (C) или в присутствии 25 нм rbIFN-α (A) или rbIFN-τ (T). Ядерные экстракты выделяли, разделяли (4 мкг) на SDS-полиакриламиде (7.5%) гели, перенесенные на нитроцеллюлозу и обнаруженные с помощью антисывороток против STAT-1, STAT-2 или IRF-1. Вестерн-блоты количественно оценивали с помощью денситометрии. Оптическую плотность анализировали с помощью защищенного t -теста. Панели B, C и D показывают количественное определение STAT-1, STAT-2 и IRF-1 соответственно. Все средства обработки представляют собой повторные или трехкратные определения. Средние, обозначенные звездочкой , отличаются от контрольных ( P <0,05).

Антитело против IRF-1 было предварительно адсорбировано пептидом IRF-1, чтобы определить, являются ли белки, иммунореагирующие с антителом против IRF-1, иммуноспецифичными (рис.5А). Предварительная абсорбция антитела против IRF-1 пептидом IRF-1 блокировала Вестерн-блот-детекцию всех, кроме одной иммунореагирующей полосы. Это интерпретируется как означающее, что все, кроме одной, иммунореагирующей полосы иммунореагируют специфически с антителом против IRF-1 и могут представлять изоформы IRF-1. Неспособность заблокировать детекцию единственной полосы даже после предварительной адсорбции с использованием молярного избытка пептида 1:10 все еще интерпретируется как иммуноспецифическая реакция. Это связано с тем, что эта полоса не появляется, когда первичное антитело удаляется из реакции вестерн-блоттинга ( i.е. (контроль, чтобы определить, иммунореагирует ли вторичное антитело неспецифически).

Рис. 5.

Обнаружение IRF-1 является иммуноспецифическим (A), и для индукции IRF-1 требуется синтез белка (B) На панели A ядерные экстракты были собраны из клеток BEND через 2 часа культивирования с 25 нм rbIFN- τ. Белки загружали в одномерные гели PAGE и проводили вестерн-блоттинг, используя антисыворотку против IRF-1, которая была предварительно адсорбирована пептидом IRF-1 в молярных отношениях 1: 0, 1: 1 или 1:10.Показан контроль, в котором первичное антитело было удалено из реакции вестерн-блоттинга (-1 ^st ). На панели B ингибирование синтеза белка с использованием циклогексимида не влияло на индукцию STAT-1 и STAT-2, но подавляло индукцию IRF-1 с помощью rbIFN-τ. Ядерные экстракты собирали из клеток BEND, культивированных в отсутствие (C) или в присутствии (T) 25 нМ rbIFN-τ и в отсутствие (контроль) и в присутствии циклогексимида. STAT и IRF определяли с помощью вестерн-блоттинга, как описано на фиг.4.

Рис. 5.

Обнаружение IRF-1 является иммуноспецифическим (A), и для индукции IRF-1 требуется синтез белка (B) На панели A ядерные экстракты были собраны из клеток BEND через 2 часа культивирования с 25 нм rbIFN-τ. Белки загружали в одномерные гели PAGE и проводили вестерн-блоттинг, используя антисыворотку против IRF-1, которая была предварительно адсорбирована пептидом IRF-1 в молярных отношениях 1: 0, 1: 1 или 1:10. Показан контроль, в котором первичное антитело было удалено из реакции вестерн-блоттинга (-1 ^st ).На панели B ингибирование синтеза белка с использованием циклогексимида не влияло на индукцию STAT-1 и STAT-2, но подавляло индукцию IRF-1 с помощью rbIFN-τ. Ядерные экстракты собирали из клеток BEND, культивированных в отсутствие (C) или в присутствии (T) 25 нМ rbIFN-τ и в отсутствие (контроль) и в присутствии циклогексимида. STAT и IRF были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга, как описано на рис. 4.

Из-за временной природы IFN-τ индукции STAT с последующей индукцией IRF-1, был проведен эксперимент, чтобы определить, требуется ли активация этих факторов транскрипции. перевод новых белков.В этом эксперименте смесь ингибиторов протеазы была включена во все реагенты, пока готовились экстракты клеток BEND. Обработка клеток BEND 25 нм rbIFN-τ эффективно индуцировала STAT-1 и STAT-2 в течение 30 мин (фиг. 5B). IRF-1 проявлял признаки индукции через 1 час, но наиболее сильно индуцировался через 2 часа после обработки IFN-τ. Опять же, даже в присутствии ингибиторов протеаз несколько полос белка иммунореагировали с антисывороткой против IRF-1, что согласуется с результатами, представленными на рис.4. Антитело против IRF-2 не иммунореагировало с ядерными белками, собранными в указанные сроки. Обработка клеток BEND циклогексимидом не влияла на индукцию STAT-1 или STAT-2 IFN-τ. Однако обработка циклогексимидом ингибировала индукцию IRF-1 в ответ на IFN-τ. Мы интерпретируем эти данные как означающие, что STAT постоянно присутствуют и индуцируются посредством фосфорилирования, чтобы проникнуть в ядро ​​и взаимодействовать с элементами ответа на генах. Один из генов, индуцируемых STAT, — это ген IRF-1.

Анализ сверхсдвига электрофоретической подвижности

Инкубация ядерных экстрактов с антисывороткой против IRF-1 вызвала сверхсдвиг в структуре полос, который был наиболее выражен в ядерных белках клеток BEND, которые были собраны через 2 часа после обработки IFN-τ (рис. 6). Эти данные интерпретируются как означающие, что IRF-1 является одним из ядерных белков, который взаимодействует с ISRE гена bISG17 в ответ на IFN-τ. Поскольку обработка ядерных экстрактов неиммунной сывороткой не влияла на сдвиг полос, можно сделать вывод, что суперсмещенная полоса была специфичной для комплекса IRF-1 / ISRE, когда использовалось антитело против IRF-1.Попытки вызвать сверхсдвиг полос при использовании антисыворотки против STAT-1 и STAT-2 потерпели неудачу (не показано).

Рис. 6.

Анализ сверхсдвига электрофоретической подвижности ядерных экстрактов из клеток BEND, обработанных 25 нм rbIFN-τ. После начальной реакции связывания экстрактов с меченым ISRE добавляли антитело против IRF-1 человека и продолжали инкубацию. на дополнительные 15 мин. Связанные комплексы разделяли с помощью PAGE, гели сушили и рентгенографировали, как описано на рис.3. Нижняя стрелка указывает положение предполагаемого комплекса IRF-1 / ISRE; верхняя стрелка отмечает суперсмещенный комплекс антитело / IRF-1 / ISRE. Время культивирования указано на верхней части геля. Обозначены инкубации с неиммунным IgG (N) или с антителом против IRF-1 (I, иммунный).

Рис. 6.

Анализ сверхсдвига электрофоретической подвижности ядерных экстрактов из клеток BEND, обработанных 25 нм rbIFN-τ. После начальной реакции связывания экстрактов с меченым ISRE добавляли антитело против IRF-1 человека и проводили инкубацию. продолжалось еще 15 мин.Связанные комплексы разделяли с помощью PAGE, гели сушили и рентгенографировали, как описано на фиг. 3. Нижняя стрелка указывает положение предполагаемого комплекса IRF-1 / ISRE; верхняя стрелка отмечает суперсмещенный комплекс антитело / IRF-1 / ISRE. Время культивирования указано на верхней части геля. Обозначены инкубации с неиммунным IgG (N) или с антителом против IRF-1 (I, иммунный).

Обсуждение

IFN-τ индуцирует транскрипцию гена ISG17 (12) и конъюгацию ISG17 с цитозольными белками матки (10).ISG17 матки похож на hISG15 по структуре (11) и функции (10) в том, что оба являются гомологами убиквитина. На основе Саузерн-геномных блотов в настоящих экспериментах был идентифицирован один главный ген ISG17. Частота обнаружения гена ISG17 в геномной библиотеке крупного рогатого скота (, т.е. 1 на 1000000) подтверждает этот вывод. Другие второстепенные полосы гибридизации на Саузерн-геномных блотах могут представлять гены, которые связаны, но, вероятно, не являются генами убиквитина, поскольку зонд ISG17 не гибридизуется с мРНК убиквитина (12).Использование кДНК hISG15 в качестве зонда в саузерн-блотах бычьего генома и использование зонда кДНК bISG17 в геномных саузерн-блотах человека не удалось даже в условиях нестрогой гибридизации (не показаны).

Поскольку был идентифицирован только один главный ген bISG17, похоже, что bISG17 является аналогом hISG15. Общая организация генов hISG15 и bISG17 одинакова. Оба гена содержат один интрон после кодона инициации. Кодирующие последовательности гена bISG17 идентичны описанным в кДНК (11).Наиболее значительным сохранением первичной структуры между bISG17 (11), hISG15 (14, 21) и убиквитином (22) являются С-концевые аминокислоты Leu-Arg-Gly-Gly, которые, как было показано, участвуют в конъюгации с внутриклеточными белки.

Ген bISG17 кодирует уникальные аминокислоты по сравнению с hISG15. Во-первых, он, по-видимому, обрабатывается иначе, чем hISG15. Стоп-кодон (TAG) в bISG17 сразу следует за нуклеотидами, кодирующими Leu-Arg-Gly-Gly, давая зрелый белок размером 17 кДа.Напротив, hISG15 имеет стоп-кодон, расположенный ниже этой последовательности (14, 23). Пре-hISG15 (17 кДа) подвергается посттрансляционной модификации, которая удаляет С-концевые аминокислоты с образованием зрелого белка (15 кДа), заканчивающегося Leu-Arg-Gly-Gly (24, 25). Три цистеина существуют в bISG17 (11), по сравнению с одним цистеином в hISG15 (14). Если в bISG17 образуются дисульфидные мостики, они могут сильно влиять на функцию из-за совершенно другой третичной структуры по сравнению с hISG15.Присутствие свободной сульфгидрильной группы на нечетном Cys в bISG17 и на одиночном Cys в hISG15 также может взаимодействовать с белками-мишенями или образовывать гомологичные димеры.

Промотор hISG15 содержит функциональный тандемный ISRE от -113 до-94 относительно кэп-сайта мРНК, но мало что известно о последовательностях, которые расположены выше этого тандемного ISRE (14). В настоящих экспериментах сайт кэпа мРНК в гене bISG17 был идентифицирован с использованием двух методов. ТАТА-бокс (ТАТТААА) был расположен в гене bISG17 в положении -29 от предполагаемого кэп-сайта.Промотор гена bISG17 был подобен промотору гена hISG15 при размещении консервативного тандемного ISRE в положении -92. Однако три дополнительных предполагаемых ISRE присутствовали в гене bISG17 в положениях -123, -332 и -525.

IFN взаимодействуют с трансмембранными рецепторами, которые связаны с тирозинкиназами, такими как Jaks и Tyks. Помимо проявления предпочтения лиганда, рецепторы сортируют внутриклеточные ответы посредством активации Jaks и Tyks, которые затем фосфорилируют по крайней мере шесть факторов транскрипции STAT (17).Анализ сдвига подвижности в настоящих экспериментах показал, что ядерные белки, индуцированные rbIFN-τ, взаимодействуют с тандемным ISRE bISG17. Одна более медленно мигрирующая полоса была индуцирована rbIFN-τ.

IFN-τ индуцировал появление STAT-1, STAT-2 и IRF-1 в ядерных белках, экстрагированных из клеток BEND. Ингибирующий фактор транскрипции IRF-2 не был обнаружен в ядерных экстрактах, собранных после обработки IFN-τ, время от времени исследованных в настоящем эксперименте. Временные отношения между появлением STAT-1 и STAT-2 (0.5 ч) и IRF-1 (2 ч) в клетках BEND согласуется с индукцией этих ядерных белков в других клетках другими IFN типа 1 (26–28). STAT активируются в течение нескольких минут после лечения IFN. Фосфорилирование цитоплазматических STAT инициирует транслокацию в ядро, образование транскрипционных комплексов и индукцию вторичных факторов транскрипции, называемых IRF. В настоящих экспериментах индукция IRF-1 блокировалась обработкой циклогексимидом, тогда как индукция STAT не затрагивалась.Таким образом, можно сделать вывод, что основная роль STAT заключается в индукции гена IRF-1, который затем через IRF-1 активирует ген bISG17.

В настоящее время не существует доказательств того, что STATs взаимодействуют с bISG17 ISRE в клетках BEND. В настоящих экспериментах попытки суперсдвига комплексов STAT / ISRE с анти-STAT-антителами не увенчались успехом, даже когда использовались ядерные экстракты, собранные после культивирования в течение 0,5, 1 или 2 ч с IFN-τ (не показаны). Однако, поскольку STAT взаимодействуют с ДНК как гетеро- или гомодимеры, неизвестно, являются ли эпитопы, распознаваемые антителами, недоступными из-за образования димеров.Антитело против IRF-1 вызывало сверхсдвиг комплекса ядерного экстракта клеток BEND / ISRE, предполагая, что IRF-1 взаимодействует с bISG17 ISRE.

Каждый член семейства IRF играет разные роли в различных системах, таких как регуляция роста клеток, передача сигнала, индуцированная цитокинами, ответ на патогены и гематопоэтическое развитие (29). Семейство IRF теперь состоит из 10 членов, которые включают IRF 1–7, фактор ISG 3γ, белок, связывающий консенсусную последовательность IFN, и вирусный IRF (29). МРНК IRF-7 существует как минимум в трех вариантах сплайсинга (30, 31).Индукция нескольких иммунореагирующих полос IRF-1 на вестерн-блоттинге в ответ на IFN-τ была неожиданной и новой находкой. Поскольку STAT проявляются в виде отдельных полос с соответствующими молекулярными массами, протеолиз, по-видимому, не происходит при приготовлении ядерных экстрактов. Несмотря на это, белки, которые иммунореагировали с антителом против IRF-1, присутствовали даже тогда, когда ядерные экстракты были изолированы в присутствии смеси ингибиторов протеаз. Наименьший сигнал иммунореагирующего IRF-1 соответствует ожидаемой молекулярной массе мыши и hIRF-1.Одиночная мРНК IRF-1 мыши размером 2 т.п.н. кодирует белок IRF-1 (37 кДа), не имеющий сайтов N-гликозилирования (32). Однако IRF-1 человека имеет восемь сайтов фосфорилирования CKII (29). Неоднородность фосфорилирования может объяснять верхние полосы M _r , которые иммунореагировали с антителом против IRF-1. Предварительная абсорбция антитела против IRF-1 с использованием пептида IRF-1 эффективно блокировала обнаружение всех, кроме одной, иммунореагирующей полосы на Вестерн-блоттинге. Белки, обнаружение которых было заблокировано, вероятно, представляют собой изоформы IRF-1 или родственные IRF-1 белки.Единственная полоса, которая не была заблокирована преадсорбцией антитела с пептидом IRF-1, также представляет интерес, поскольку она иммунореагирует с антителом против IRF-1, отсутствует, когда вторичное антитело удалено, и индуцируется IFN-τ способом, который идентичны другим иммунореагирующим полосам.

IRF-2 не обнаруживался в экстрактах клеток BEND через 0,5, 1 или 2 часа после обработки IFN-τ. IRF-2 считается антагонистом IRF-1, поскольку он является негативным регулятором генов, активируемых IRF-1 (29).Предположительно, IRF-2 действует как конкурентный антагонист, потому что он имеет ту же специфичность связывания ДНК, что и IRF-1, и конкурирует за тот же сайт связывания (33). Таким образом, было предложено, что ISG либо активируются, либо ингибируются в зависимости от отношения IRF-1 к IRF-2. В настоящих экспериментах соотношение этих двух факторов транскрипции способствует активации промотора bISG17 в течение исследованного времени.

Был выделен один главный ген, кодирующий bISG17. Этот ген, вероятно, является аналогом гена hISG15, но он кодирует белок, который больше, чем hISG15, и содержит несколько мутаций в функциональных аминокислотных остатках.Было показано, что оба белка функционируют как гомологи убиквитина путем конъюгирования с цитозольными белками. Судьба белков, конъюгированных с bISG17, еще предстоит определить, но, возможно, не связана с быстрой деградацией через протеасомы. Промоторы для этих генов похожи, но здесь сообщается о наличии трех дополнительных предполагаемых ISRE в гене bISG17. То, что это функциональные ISRE, еще предстоит определить с помощью сайт-направленного мутагенеза и анализа делеций. Используя новую клеточную линию BEND, Вестерн-блоттинг и EMSA, мы продемонстрировали, что IFN-τ индуцирует фосфорилирование STAT-1 и STAT-2, которые затем индуцируют IRF-1.IRF-1 был вовлечен во взаимодействие с bISG17 ISRE посредством анализа сверхсдвига EMSA. Поскольку не было показано, что STAT взаимодействуют с этим ISRE, мы подозреваем, что IRF-1 является прямым активатором транскрипции гена bISG17. Прекращение передачи сигнала будет в центре внимания будущих экспериментов и может включать убиквитинирование STATs (34) и последующую индукцию IRF-2.

Материалы и методы

Материалы

Эндонуклеазы рестрикции были получены от Promega Corp.(Мэдисон, Висконсин) или New England Biolabs, Inc. (Беверли, Массачусетс). Олигонуклеотиды для экспериментов по секвенированию и удлинению праймеров были синтезированы Life Technologies (Gaithersburg, MD). Радиоактивно меченые нуклеотиды были получены от New England Nuclear (Бостон, Массачусетс) или Amersham (Арлингтон-Хайтс, Иллинойс). Все остальные химические вещества были от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури) или Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания) и имели чистоту реагента или выше.

Саузерн-блоттинг

ДНК тимуса теленка (10 мкг) (Sigma Chemical Co.) был полностью расщеплен Bam HI, Eco RI, Hin dIII, Pst I, Sma I или Sac I. (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) и разделяли электрофоретически при 20 В в течение ночи. Фрагменты ДНК переносили на нейлоновые мембраны (0,2 мкм, Nytran +; Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH), сушили, фиксировали путем запекания при 80 ° C и гибридизовали с кДНК bISG17, меченной случайным праймером (11).Процедуры прегибридизации, гибридизации и промывки были идентичны описанным при скрининге геномной библиотеки крупного рогатого скота. Саузерн-блоты экспонировали на рентгеновской пленке (Fuji RX; Fisher Scientific) в течение 12 дней.

Просмотр библиотеки

Геномная библиотека крупного рогатого скота λGEM-11, сконструированная из ДНК сперматозоидов (Promega Corp.), была подвергнута скринингу (20) с использованием радиоактивно меченной кДНК bISG17 в качестве зонда (11). Приблизительно 10 ⁶ бляшек высевали с Escherichia coli Y1090 из расчета 25000 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 150-миллиметровый планшет.Бляшки переносили на нейлоновые мембраны Biotrans (размер пор 0,45 мкм) (ICN Biomedicals, Inc.; Ирвин, Калифорния), денатурировали 0,5 н. NaOH и 1,5 м NaCl, нейтрализовали 0,5 м Трис-HCl (pH 7,5) и 1,5 мл. NaCl и дважды промывали 2 × SSC (где 1 × SSC — 0,15 м NaCl, 15 мМ цитрат натрия). Мембраны запекали (2 часа, 80 ° C), прегибридизовали (3 часа; 50% формамид, 5 × SSC, 0,05 м фосфат натрия, 5 × раствор Денхардта, 0,1% SDS, 0,1 мг / мл ДНК спермы лосося), гибридизовали (18 ч), промывали трижды (15 мин: 2 × SSC / 0.1% SDS, 1 × SSC / 0,1% SDS, 0,1 × SSC / 0,1% SDS) (42 ° C) и помещены на пленку Fuji RX (Fisher Scientific) на 24 часа. Выявлена ​​одна положительная бляшка.

После двух раундов очистки бляшек фаг очищали с использованием системы очистки ДНК Wizard Lambda (Promega Corp.), и вставку вырезали путем расщепления с помощью Sac I. Было обнаружено, что вставка фага содержит внутренний Sac I. сайтов и дали два рестрикционных фрагмента, 2,0 и 3,4 т.п.н., которые реагировали с зондом кДНК bISG17 на Саузерн-блоттинге.Эти фрагменты очищали в геле и субклонировали в pBluescript SK ^— (Stratagene; La Jolla, CA). Плазмиды, содержащие вставки размером 3,4 и 2,0 т.п.н., были обозначены как pDP7 и pDP8 соответственно.

Секвенирование ДНК

Дидезокси-секвенирование проводили со стандартными прямым и обратным праймерами M13 с использованием Sequenase (Amersham). Клон pDP7 содержал 3′-конец гена bISG17 из сайта Sac I, о котором известно, что он находится в положении 416 кДНК bISG17 (11).Этот клон секвенировали по сайту полиаденилирования. Клон pDP8 содержал нуклеотиды, расположенные выше положения 416 кДНК bISG17, и был полностью секвенирован с использованием вложенных делеций, созданных системой Erase-a-base (Promega Corp.), и четырех дополнительных праймеров в положениях -260, -160, 595 и 751 (относительно предполагаемого участка кэпа).

Идентификация сайта кэпа мРНК с использованием удлинения праймера

Эндометрий собирали у коровы на 18 день эстрального цикла (отрицательный контроль) и беременности.Этот день беременности был выбран для представления времени, в течение которого ген bISG17 транскрибируется на высоких уровнях (12). Тотальную РНК экстрагировали из ткани эндометрия с использованием реагента Tri (Molecular Research Center, Inc.; Цинциннати, Огайо), как описано ранее (12). РНК (20 мкг) объединяли с 10 ⁵ имп / мин олигонуклеотидного праймера с концевой меткой (CACCATGGCCGTGGGTTCTGG), который был выбран так, чтобы концы на 15 оснований находились выше кодона инициации. Использовали два метода удлинения праймера. В первом, более продолжительном методе гибридизации (35), РНК и меченый на конце олигонуклеотид растворяли в 30 мкл гибридизационного буфера (3 м NaCl, 0.5 м HEPES, pH 7,5, 1 мМ EDTA), инкубировали при 85 ° C в течение 10 мин, а затем инкубировали в течение 8 ч при 30 ° C. После осаждения этанолом примированную РНК растворяли в 10 мМ Трис-HCl, pH 9,0, 50. мМ KCl, 1 мМ дезоксинуклеозидтрифосфаты, 10 мМ MgCl ₂ и 40 ед. РНКзина (Promega Corp.). Добавляли обратную транскриптазу MMLV (вирус лейкемии Молони мыши) (200 ед., Gibco BRL; Bethesda, MD), и смесь инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Добавляли рибонуклеазу (10 мкг; Promega Corp.) и ЭДТА (конечная концентрация 25 мМ) и инкубацию продолжали еще 30 мин.Продукт удлинения экстрагировали один раз фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом (25: 24: 1), осаждали этанолом и растворяли в 10 мкл буфера для загрузки геля для секвенирования (10 мМ ЭДТА, 95% формамид, 0,1% бромфенолового синего, 0,1% ксилола. цианол). Образцы нагревали до 95 ° C в течение 5 мин.

Во втором, более коротком методе гибридизации (36) осадок РНК / праймера растворяли в 10 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, pH 8,3, 50 мМ KCl, 1 мМ дезоксинуклеозидтрифосфаты, 10 мМ MgCl ₂ , 10 мм дитиотреитол (ДТТ), 0.5 мМ спермидина, нагревают до 60 ° С в течение 20 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры в течение 10 мин. Добавляли обратную транскриптазу MMLV (вирус лейкемии Молони мыши) (40,5 ед .; 6 мМ пирофосфат натрия) и смесь инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 20 мкл буфера для загрузки геля для секвенирования, как описано выше, и нагреванием до 90 ° C в течение 10 мин. Продукты удлинения праймера анализировали на 6% геле для секвенирования рядом с лестницей дидезокси-секвенирования для определения точной длины продуктов.

Культура клеток

Линия клеток эндометрия крупного рогатого скота, называемая клетками BEND (13), культивировалась в среде, состоящей из 40% MEM (Sigma Chemical Co.), 40% Ham’s F-12, 10% FCS (инактивированный нагреванием), 10% лошадиной сыворотки (инактивированный нагреванием). ), 1% ABAM (раствор антибиотика антимикотика, Sigma Chemical Co.) и инсулин (0,2 Ед / мл). Клетки (2 × 10 ⁶ ) помещали в 75-см колбы ² (Корнинг, Кембридж, Массачусетс) при 37 ° C и 5% CO ₂ . После достижения приблизительно 90% слияния клетки культивировали с 0 или 25 нм rbIFN-τ или rbIFN-α в течение указанного времени в бессывороточной среде.При необходимости добавляли циклогексимид (50 мкг / мл) (37) и rbIFN-τ (25 нм).

Ядерные экстракты

Ядерные экстракты получали модификацией метода Saatcioglu et al. (38). По назначению коктейль ингибиторов протеазы (лейпептин, 0,6 Ед / мл; пепстатин, 1 Ед / мл; апротинин, 10 Ед / мл; фенилметилсульфонилфторид, 1 мМ; и ЭДТА, 1 мМ) добавляли ко всем буферам после первоначального сбора ячеек BEND. Культивируемые клетки BEND дважды промывали, собирали (4 ° C) в 10 мМ HEPES (pH 7.5) и гранулированный (1700 × г ). Осадки клеток ресуспендировали в 5 объемах 10 мМ HEPES (pH 7,5), инкубировали на льду в течение 10 минут и снова осаждали. Клетки ресуспендировали в 2 об. 3 мМ MgCl ₂ , 1 мМ DTT, 25 мМ HEPES (pH 7,5), 0,3% (об. / Об.) NP40 и разбивали 15 взмахами в гомогенизаторе Даунса (плотный пестик). Гомогенат немедленно центрифугировали в течение 20 секунд в микроцентрифуге Eppendorf (Brinkman Instruments, Inc., Вестбери, штат Нью-Йорк) (12000 × г ). Неочищенную ядерную таблетку суспендировали в 2 об. 0.1 м KCl, 1 мМ DTT, 25 мМ HEPES, pH 7,5. Ядра лизировали добавлением 2 м KCl, достаточного для получения раствора 0,4 мл, и осторожно перемешивали при 4 ° C в течение 15 мин. Лизат доводили до 20% в глицерине (об. / Об.) И центрифугировали (12000 × г ) в течение 15 мин при 4 ° С. Концентрацию белка в супернатанте анализировали с помощью анализа Coomassie Blue (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA), аликвоты и хранение при -80 ° C.

Emsa

Ядерные экстракты (5 мкг) инкубировали приблизительно с 20000 имп / мин (20 фмоль) меченного по концам двухцепочечного олигонуклеотида ISRE (GGGAAAAGGAAACCGAAACT; на основе последовательности промотора bISG17) в присутствии 1 мкг поли (dI-dC ) · Поли (dI-dC) (Sigma Chemical Co.) в конечном объеме 10 мкл, как описано ранее (38). Реакции связывания завершали в 25 мМ HEPES, pH 7,5, 1 мМ EDTA, 0,7 мМ DTT, 100 мМ KCl и 10% глицерине при комнатной температуре в течение 10 мин. Образцы наслаивали на 6% полиакриламидные гели (соотношение акриламид / бисакриламид 19: 1) в буфере, состоящем из 20 мм Трис, 20 мм HEPES, 1 мм EDTA, pH 8,0, и подвергали электрофорезу при 100 В в течение 90 мин при комнатной температуре. Гели на короткое время фиксировали в 50% (об. / Об.) Этаноле, 7% (об. / Об.) Уксусной кислоте и переносили на бумагу 3MM (Whatman, Clifton, NJ), сушили и рентгенографировали.Для конкурентных экспериментов немеченый двухцепочечный ISRE добавляли к стандартной реакции связывания при приблизительно 1-, 10- и 100-кратном молярном избытке (0,03 пмоль, 0,3 пмоль и 3 пмоль) по сравнению с меченным ³² P ISRE.

Для анализа суперсдвига на основе антител (39) все стандартные компоненты образца были объединены и инкубированы при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли антитела против IRF-1, STAT-1 или STAT-2 (1 мкг, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Калифорния) или неиммунный кроличий IgG (1 мкг), и инкубацию продолжали в течение дополнительного За 15 мин до того, как образцы были загружены в 4% неденатурирующие одномерные гели для ПААГ.

Радиомаркировка зондов

кДНК bISG17 для саузерн-блотов метили [α — ³² P] dCTP с использованием процедуры случайного праймера (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Олигонуклеотиды для анализов удлинения праймеров и сдвигов подвижности метили по концам [γ- ³² P] АТФ с помощью полинуклеотидкиназы с использованием стандартных процедур (35). Меченые по концам олигонуклеотиды для анализа сдвига подвижности отжигали с 10-кратным избытком комплементарной немеченой цепи, чтобы гарантировать, что вся метка содержится в двухцепочечной ДНК.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинга проводили, как описано ранее (4, 7, 12). Ядерные экстракты (4 мкг на дорожку) разделяли на 7,5% SDS-полиакриламидных гелях, переносили на нитроцеллюлозу и детектировали с помощью первичных антител против человеческого STAT-1 (E-23), человеческого STAT-2 (C-20), человеческого IRF. -1 (C-20) или IRF-2 человека (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Первичные антитела разводили до 1,0 мкг / нл. Второе антитело представляло собой конъюгат против щелочной фосфатазы IgG кролика (1: 5000; Promega Corp.).

Предварительная абсорбция антител против IRF-1

Ядерные экстракты получали из клеток BEND, которые инкубировали с 25 нМ rbIFN-τ в течение 2 часов. Экстрагированные белки разделяли с помощью одномерного PAGE и вестерн-блоттинга, как описано выше, с антителом против IRF-1, которое было предварительно адсорбировано (1 час, 25 ° C с 1: 0, 1: 1 или 1:10 молярным избытком IRF- 1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Контроль, в котором первичное антитело было удалено из реакции вестерн-блоттинга, был включен, чтобы определить, иммунореагирует ли второе детектирующее антитело неспецифически.

Благодарности

Авторы благодарят доктора А. Л. Хааса (Медицинский колледж Висконсина, Милуоки, Висконсин) за кДНК hISG15 и доктора Р. М. Робертса (Университет Миссури, Колумбия, Миссури) за рекомбинантные интерфероны.

Это исследование было поддержано грантом NIH R29 HD-32475.

Список литературы

Thatcher

WW

Meyer

MD

Danet-Desnoyers

G

1995

Признание беременности матерью.

J Reprod Fertil Suppl

49

15

28

Bazer

FW

Spencer

TE

Ott

TL

a

сигнал распознавания беременности.

Am J Reprod Immunol

37

412

420

Робертс

RM

Malathy

PV

Hansen

TR

K

1990

Секреторные продукты крупного рогатого скота conceptus, участвующие в распознавании беременности.

28

38

Godkin

JD

Smith

SE

Johnson

RD

Dore

Роль интерферонов трофобластов в поддержании беременности на ранних сроках у жвачных животных.

Am J Reprod Immunol

37

137

143

Hansen

TR

Austin

KJ

Perry

DJ

MG

Johnson

GA

1999

Механизм действия интерферона-τ в матке на ранних сроках беременности.

J Reprod Fertil [Suppl 54], в печати

Austin

KJ

Ward

SK

Teixeira

MG

Dean

VC

Hansen

TR

1996

Перекрестно-реактивный белок убиквитин высвобождается маткой крупного рогатого скота в ответ на интерферон на ранних сроках беременности.

Biol Reprod

54

600

606

Hershko

A

Ciechanover

A

1992

Система деградации белка.

Annu Rev Biochem

61

761

807

Finley

D

Chau

V

1991

Убиквитинирование.

Annu Rev Cell Biol

7

25

69

Driscoll

J

Goldberg

AL

1990

Протеасома (мультикат) является протеасомным компонентом 1500 -kDa протеолитический комплекс, который расщепляет убиквитин-конъюгированные белки.

J Biol Chem

265

4789

4792

Johnson

GA

Austin

KJ

Кирк

EA

Беременность и интерферон-τ индуцируют конъюгацию бычьего белка, перекрестно реагирующего на убиквитин, с цитозольными белками матки.

Biol Reprod

58

898

904

Austin

KJ

Pru

JK

Hansen

TR

Эндокринная

5

191

197

Hansen

TR

Austin

KJ

Johnson

GA

перекрестная экспрессия белка

1997 Транзитный ген

в эндометрии крупного рогатого скота.

Эндокринология

138

5079

5082

Staggs

KL

Austin

KJ

MG Johnson

GA

Dooley

VA

Hansen

TR

1998

Комплексная индукция белков матки крупного рогатого скота интерфероном-τ.

Biol Reprod

59

293

297

Рейх

N

Evans

B

Levy

D

E

Jr

JE

1987

Интерферон-индуцированная транскрипция гена, кодирующего белок 15 кДа, зависит от расположенного выше энхансерного элемента.

Proc Natl Acad Sci USA

84

6394

6398

Леви

D

Larner

A

Chaudhuri

A

Jr

JE

1986

Транскрипция, моделируемая интерфероном: выделение индуцибельного гена и идентификация его регуляторной области.

Proc Natl Acad Sci USA

83

8929

8933

Pestka

S

Langer

JA

Zoon

000

KC

Интерфероны и их действие.

Annu Rev Biochem

56

727

777

Darnell

Jr

JE

1997

STAT и генное регулирование.

Наука

277

1630

1635

Харада

H

Takahashi

E

Itoh

S

Taniguchi

T

1994

Структура и регуляция генов человеческого фактора регуляции интерферона 1 (IRF-1) и IRF-2: значение для генной сети в системе интерферона.

Mol Cell Biol

14

1500

1509

Lowe

J

Mcdermott

H

Loeb

K

Landon

AL

Mayer

RJ

1995

Иммуногистохимическая локализация перекрестно-реактивного белка убиквитина в тканях человека.

J Pathol

177

163

169

Hansen

TR

Leaman

DW

Cross

JC

Mathial

Mathial JA

Roberts

RM

1991

Гены интерферонов трофобласта и родственного интерферона αII обладают отдельными 5′-промоторными и 3′-фланкирующими последовательностями.

J Biol Chem

266

3060

3066

Нарасимхан

J

Potter

JL

Haas

J Biol Chem

271

324

330

Wilkinson

KD

Audhya

TK

1981

-зависимый протеин Стимуляция АТ последовательность Arg-Gly-Gly.

J Biol Chem

256

9235

9241

Blomstrom

DC

Fahey

D

Kutny

R 9000rrant8,

E

1986

Молекулярная характеристика индуцированного интерфероном белка массой 15 кДа.

J Biol Chem

261

8811

8816

Feltham

N

Jr

M

Cordova

B

B Fahey,

B

Blomstrom

D

Jr

E

1989

Интерферон-индуцированный белок массой 15 кДа и его предшественник 17 кДа: экспрессия в Escherichia coli, и характеристика, очистка , .

J Интерферон Res

9

493

507

Knight

Jr

E

Fahey

D

Cordova

B

Cordova

R

Reich

N

Blomstrom

D

1988

Интерферон-индуцированный белок массой 15 кДа получают с помощью COOH-концевого процессинга предшественника 17 кДа.

J Biol Chem

263

4520

4522

Бинелли

M

Subramaniam

PS

Thatcher

Biol Reprod 54 [Suppl 1]: 450

Binelli

M

Diaz

T

Hansen

TR

Thatcher

WW

Biol Reprod 58 [Suppl 1]: 214

Spencer

TE

Ott

TL

Bazer

FW

1998

Нормативные факторы экспрессии в эндометрии овцы: влияние беременности и интерферона овцы τ.

Biol Reprod

58

1154

1162

Nguyen

H

Hiscott

J

Pitha

Interval .

Cytokine Growth Factor Rev

8

293

312

Zhang

L

Pagano

JS

1997

Mol Cell Biol

17

5748

5757

Au

WC

Moore

PA

LaFleur

DW

ha

PM

1998

Характеристика фактора регуляции интерферона-7 и его потенциальная роль в активации транскрипции генов интерферона А.

J Biol Chem

273

29210

29217

Миямото

M

Fujita

T

Кимура

H

Sudo

Y

Miyata

T

Taniguchi

T

1988

Регулируемая экспрессия гена, кодирующего ядерный фактор IRF-1, который специфически связывается с IFN-β. генные регуляторные элементы.

Cell

54

903

913

Tanaka

N

Kawakami

T

Taniguchi

T

регуляторных последовательностей (IRF-1) и IRF-2, регуляторы роста клеток и интерфероновой системы.

Mol Cell Biol

13

4531

4538

Kim

TK

Maniatis

T

1996

Регулирование протеасома ST-γ интерфероном-γ-интерфероном путь.

Science

273

1717

1719

Sambrook

J

Fritsch

EF

Maniatis

T

Cold Spring Harbor Press

Cold Spring Harbor, NY,

7.79

7.83

Doyle

K

1996

Протоколы и руководство по применению

Promega Corp, Madison, WI

310

312

Waring

P

1990

Фрагментация ДНК, индуцированная в макрофагах под действием глиотоксина, не требует синтеза белка и предшествует повышенному инозитолу. уровни трифосфата.

J Biol Chem

265

14476

14480

Saatcioglu

F

Perry

DJ

Pasco

ДНК-связывающая активность арилуглеводородного (Ah) рецептора: специфичность последовательности и требование Zn ²⁺ .

J Biol Chem

265

9251

9258

Kristie

TM

Roizman

B

1986

1 вирус герпеса, основной белок вируса герпеса стабильно и специфически связаны с промоторно-регуляторными доменами α-генов и некоторых других вирусных генов.

Proc Natl Acad Sci USA

83

3218

3222

Авторские права © 1999, Общество эндокринологов

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

% PDF-1.6 % 1 0 объект > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 2 0 obj > / Шрифт> >> / Поля [] >> эндобдж 3 0 obj > поток 2016-11-08T15: 38: 40 + 01: 002016-11-08T15: 38: 34 + 01: 002016-11-08T15: 38: 40 + 01: 00Adobe InDesign CS5 (7.0.4) application / pdfuuid: 00e4c596-6493-4271-bdd5-d175b255130fuuid: 9343ebbd-bfb7-430e-8b90-2f80da060c41 Adobe PDF Library 9.9 конечный поток эндобдж 4 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > / XObject> >> / Аннотации [39 0 R] / Родитель 9 0 R / MediaBox [0 0 595 842] >> эндобдж 14 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 15 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 16 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 17 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 18 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 19 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 20 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / Свойства> / MC1> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 21 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / Свойства> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680.315] / Тип / Страница >> эндобдж 22 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 23 0 объект > / ExtGState> / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Свойства> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 24 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 25 0 объект > / ExtGState> / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Свойства> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 26 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 27 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 28 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / Свойства> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 29 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / Свойства> >> / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 30 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 31 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 32 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 33 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 34 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 35 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 481,89 680,315] / Тип / Страница >> эндобдж 36 0 объект > поток xWMoF] 7ʵ

Онлайн-заявки на экспортные сертификаты для пищевых продуктов

Промышленность может запросить большинство типов экспортных сертификатов FDA на пищевые продукты через систему подачи заявок на экспортную сертификацию и отслеживания (CFSAN eCATS).CFSAN eCATS — одна из отраслевых систем FDA, доступная по адресу https://www.access.fda.gov. CFSAN eCATS имеет разные модули для разных типов экспортных сертификатов. Перейдите по ссылкам ниже, чтобы получить пошаговые инструкции по подаче заявки на экспортные сертификаты.

Модуль CFSAN eCATS

Industry может запросить «Сертификат для иностранного правительства» и «Сертификат экспортной пригодности» через модуль CFSAN eCATS. Эти сертификаты доступны для обычных продуктов питания, пищевых добавок, веществ, контактирующих с пищевыми продуктами, и детских смесей.

Скачать пошаговые инструкции CFSAN eCATS
PDF: 1.6MB

Советы по полному применению через CFSAN eCATS

FDA может обрабатывать полные заявки намного быстрее, чем заявки, по которым нам нужно запрашивать дополнительную уточняющую информацию. Вы можете ознакомиться со следующими советами, чтобы подать заявку полностью.

• Все этикетки продуктов и сопроводительная документация должны быть на английском языке или сопровождаться английским переводом.
• Между производителем и товарами, указанными в заявке, должна быть четкая связь. Если этикетка продукта не включает название и адрес производителя, вы можете загрузить подтверждающую документацию через раздел «Дополнительные документы», чтобы продемонстрировать связь между продуктами и производителем (например, подписанное письмо производителя на фирменном бланке компании). .
• Если производственное предприятие не проверялось FDA, вы можете загрузить отчет об инспекции из другого федерального, государственного или местного регулирующего органа через раздел «Дополнительные документы», чтобы продемонстрировать соответствие применимым U.С. требования.
• Для пищевых добавок и веществ, контактирующих с пищевыми продуктами, если на этикетке продукта четко не указаны ингредиенты или вещества, используемые для производства конечного продукта, вы можете загрузить листы спецификаций или другую документацию через раздел «Дополнительные документы», чтобы продемонстрировать связь между продуктом.