Проверка ифнс юл: Сервисы и госуслуги

Содержание

Ошибки при работе на портале ФНС nalog.ru — Удостоверяющий центр СКБ Контур

При проверке условий подключения и защищённого соединения с сервером Личного кабинета возникла ошибка «Не удалось обратиться к серверу с использованием защищенного соединения. Возможно, не установлено доверие между клиентом и сервером…»

Если вы работаете на сайте ФНС с одного ПК с несколькими учётными записями (сертификатами), при каждой смене учётной записи необходимо чистить SSL (Сервис — Свойства браузера — Содержание — Очистить SSL).

1. Пройдите диагностику и выполните рекомендуемые действия.

2. Если электронная подпись установлена на носитель Рутокен ЭЦП 2.0, воспользуйтесь инструкцией и установите Рутокен.Коннект (см. Поддерживаемые браузеры).

3. Перейдите напрямую в нужный ЛК, минуя проверки, заменив в адресной строке протокол http на https. Для Личного кабинета ЮЛ вместо http://lkul.nalog.ru/ нужно перейти на https://lkul.nalog.ru/, для Личного кабинета ИП — https://lkipgost.nalog.ru/lk. Если получится войти — используйте этот способ всегда.

4. Проверьте работу в браузерах:

— Спутник
Примечание: после запуска скачанного установочного файла перейдите в раздел «Настройки» и уберите галку с пункта «Установить КриптоПро CSP для поддержки защищенных каналов на основе ГОСТ шифрования и цифровой подписи».

— Яндекс.Браузер
После установки браузера зайдите в его настройки и включите поддержку ГОСТ-шифрования («Настройки» — «Системные» — «Сеть»):

5. Проверьте, что в антивирусе не включено https-сканирование (часто встречается в антивирусах Avast и ESET).

6. Запустите программу КриптоПро CSP с правами администратора. Перейдите на вкладку «Настройки TLS» и снимите галочку «Не использовать устаревшие cipher suite-ы». После изменения данной настройки нужно обязательно перезагрузить компьютер.

7. После перезагрузки компьютера поставьте галочку «Не использовать устаревшие cipher suite-ы»

в настройках КриптоПро CSP на вкладке «Настройки TLS», не соглашайтесь с предложением о перезагрузке.

8. Установите корневые сертификаты 2016, 2017 и 2018 годов с сайта https://www.gnivc.ru/certification_center/kssos/ в хранилище «Промежуточные центры сертификации».

9. Если на компьютере установлены другие СКЗИ (VipNet CSP, Континент-АП, Агава и др.), удалите их или перейдите на другое рабочее место. Корректная работа с несколькими криптопровайдерами на одном ПК не гарантируется.

При работе в ЛК физического лица появляется окно (не окно КриптоПро) с требованием ввести пароль, но при этом пароля на контейнере нет или стандартный пин-код от токена не подходит.

1. Войдите в Личный кабинет Физического лица.

2. Откройте страницу «Главная» — «Профиль» — «Получить электронную подпись».

3. Если на открывшейся странице выбрана ЭП — удалите подпись и зарегистрируйте КЭП заново.

При регистрации Юридического лица появляется ошибка «У Вас отсутствуют полномочия действовать от лица организации без доверенности».

Для юридических лиц в сервисе «Личный кабинет налогоплательщика» первичную регистрацию можно выполнить с КЭП, выданным на руководителя, указанного в ЕГРЮЛ как лицо, имеющее право действовать без доверенности, либо на лицо, имеющее действующую доверенность с полными полномочиями (доверенность с полными полномочиями должна быть передана и зарегистрирована в налоговой. Процесс входа описан на сайте ФНС, раздел «Регистрация лицом, имеющим действующую доверенность с полными полномочиями»).

Для управляющей компании КЭП должен содержать ФИО руководителя управляющей компании и реквизиты (ИНН, ОГРН) той организации, управление которой осуществляется. Также перед первым входом по сертификату дочерней организации требуется зарегистрировать в ФНС доверенность на руководителя УК.

Контакты nalog.ru

По вопросам работы на портале и ошибкам, не связанным с настройкой рабочего места и электронной подписью, обратитесь в службу поддержки портала ФНС:
— Телефон: 8 (800) 222-22-22
— Форма обращения в техподдержку ФНС

Личный кабинет юридического лица ИФНС

Юридические лица могут получить доступ к личному кабинету на сайте ФНС. Однако, перед использованием функций сервиса, налогоплательщики должны выполнить ряд технических условий

Регистрация и авторизация

Для того чтобы организации моАгли получить доступ к личному кабинету, им необходимо иметь квалифицированную электронную подпись, выданную в Удостоверяющем центре, аккредитованном Минкомсвязи России.

Важным условием является наличие сертификата ключа с ГОСТ-2012. Налогоплательщики, использующие сертификаты ключей с 2001-ГОСТ не смогут получить доступ к личному кабинету.

Перед регистрацией в «Личном кабинете юридического лица», налогоплательщик должен провести техническую диагностику. Её можно провести двумя способами.

Диагностика подключения по сертификату электронной подписи

Перед подключением к личному кабинету, налогоплательщику нужно выполнить следующие действия:

Установить криптопровайдер с поддержкой алгоритмов шифрования ГОСТ 34.10-2001, ГОСТ 28147-89, ГОСТ Р 34.11-2012. Одним из таких криптопровайдеров является «КриптоПро CSP 5.0».

Установить браузер, поддерживающий стандарты, описанные в предыдущем пункте. Подходят практически все современные браузеры — Google Chrome, Яндекс.Браузер и т.д. Браузеры нужно обновить до последней актуальной версии.

Установить сертификаты ключей проверки электронной подписи головного Удостоверяющего Центра и удостоверяющего центра Минкомсвязи, а также самоподписанный квалифицированный сертификат ключа проверки электронной подписи в «Доверенные корневые центры».

Остальные сертификаты из КСКПЭП должны быть установлены в «Промежуточные центры сертификации».

КСККЭП, который был выдан юридическому лицу удостоверяющим центром, должен быть установлен в хранилище «Личные»

Открыть порты 80 и 443 должны для отправки и приёма данных.

Узлы http://lkul.nalog.ru и https://lkul.nalog.ru нужнов зону надёжных узлов

Диагностика подключения по сертификату ЕГАИС на аппаратном ключе

Эту диагностику необходимо выполнить тем ЮЛ, которые используют «Рутокен ЭЦП 2.0» в качестве носителя. Налогоплательщик выполнить следующие действия:

Завести КЭП — квалифицированную электронную подпись — по шаблону «Сертификат для ЕГАИС».

Установить программу «Рутокен Коннект». Дополнительные компоненты и плагины для браузеров автоматически установятся вместе с «Рутокен Коннект».

Выбрать сертификат электронной подписи и введите PIN-код «Рутокена».

Перейти на страницу проверки условий подключения.

После проделанных шагов в личном кабинете появится возможность авторизации выбранным методом.

Получить электронную подпись можно в удостоверяющем центре. АО «Калуга Астрал» предоставляет два продукта:

Возможности личного кабинета на 2020 год

Юридические лица подключаются к личному кабинету, чтобы пользоваться удалёнными услугами, которые он предоставляет. Основными функциями личного кабинета для ООО являются:

В личном кабинете также указывается ход исполнения тех или иных заявлений. Таким образом, ЮЛ может самостоятельно контролировать сроки исполнения услуг без необходимости личного визита в налоговую инспекцию.

ФНС предоставляет личный кабинет для юридических лиц со множеством функций. С помощью этого сервиса организации могут получать услуги налоговой в удалённом формате.

Техподдержка: Инструкция по использованию электронной подписи на сайте Федеральной налоговой службы

Оглавление

Внимание! В соответствии с пунктом 3 статьи 80 и с пунктом 5 статьи 174 Налогового кодекса Российской Федерации налоговые декларации по налогу на добавленную стоимость через сервис ФНС не принимаются. Также, согласно пункту 10 статьи 431 Налогового кодекса Российской Федерации расчеты по страховым взносам через настоящий сервис не принимаются.

Установка Программы «Налогоплательщик ЮЛ»

На сайте ФНС https://www.nalog.ru/rn77/program/5961229/ скачать файл с последней версией программы и запустить установку двойным кликом мыши:

После распаковки и подготовки файлов к установке откроется окно установки программы, в котором необходимо нажать «Далее»:

Прочитать лицензионное соглашение и принять его условия, нажать «Далее»:

Выбрать «Полную» установку и нажать «Далее»:

Если необходимо, можно изменить папку установки программы, нажав «Изменить…».

Далее нажать «Далее»:

Для начала установки нажать «Установить»:

Для завершения установки программы нажать «Готово»:

После успешной установки на рабочем столе появится ярлык «Налогоплательщик ЮЛ». Также в системном меню WINDOWS Пуск – Программы появится подпункт «Налогоплательщик ЮЛ», содержащий ссылки на исполняемую программу и руководство пользователя.

При первом запуске программы после установки версии будет показано окно с описанием версии, далее выполнится конвертация программы, переиндексация, после чего появится запрос на прием отчетных форм. Затем произойдет прием описаний в выбранном варианте. После этого программа будет готова к работе. Работа в программе Налогоплательщик описана в файле «Руководство пользователя.doc» Пуск – Программы – Налогоплательщик ЮЛ – Руководство пользователя.

Формирование транспортного контейнера в программе «Налогоплательщик ЮЛ»

После формирования декларации или загрузки существующей, необходимо ее выгрузить для формирования транспортного контейнера. Для выгрузки документа нужно правым кликом мыши кликнуть на отчет. При этом если помечен документ или группа документов, то будут выгружены помеченные документы. Если нет помеченных документов, то будет выгружен документ, на котором установлен курсор.

В выпадающем меню выбрать «Передача по Интернет».

Откроется список отмеченных для выгрузки документов:

Нажать «ОК».

Откроется окно со служебной информацией:

В нем необходимо заполнить код ИФНС, в которую отправляется отчетность. И подтвердить введенные данные нажатием кнопки «ОК».

Если заполнены все необходимые поля, отчетность будет выгружена.

После нажатия кнопки «ОК» откроется окно формирования транспортного контейнера:

В нем необходимо указать папку, в которой будет размещен файл с транспортным контейнером, идентификатор налогоплательщика, сертификат ключа подписи, которым будет подписан передаваемый файл отчетности и нажать кнопку «Сформировать».

Для подписания отчетности будет запрошен пароль на контейнер:

После ввода пароля и нажатия кнопки «ОК» будет сформирован контейнер:

Получение идентификатора налогоплательщика

Для самостоятельной регистрации налогоплательщиков в системе сдачи налоговой отчетности и получения идентификатора необходимо пройти регистрацию в сервисе: https://service.nalog.ru/reg/Account/Registry:

Для регистрации необходимо ввести Логин, Пароль, Подтверждение пароля и E-mail:

После нажатия кнопки «Зарегистрировать» на электронную почту будет выслано письмо с ссылкой для подтверждения регистрации:

После подтверждения электронной почты и входа в личный кабинет появится сообщение о необходимости зарегистрировать сертификат и получить идентификатор:

После нажатия на кнопку «Зарегистрировать сертификат» откроется форма для загрузки сертификата:

После выбора файла сертификата откроется окно со сведениями об организации, в котором необходимо будет заполнить пустые поля (КПП и Код налогового органа):

Затем нажать кнопку «Передать на регистрацию». Страница обновится и отобразится статус заявки на регистрацию сертификата:

Когда сертификат пройдет регистрацию и будет присвоен идентификатор, на почту (указанную при регистрации) придет сообщение об успешной регистрации и о присвоении идентификатора.

После обновления страницы изменится статус регистрации сертификата, и в данных организации отобразится присвоенный идентификатор:

Для представления отчетности необходимо использовать «Сервис сдачи налоговой и бухгалтерской отчетности».

Представление отчетности в ФНС

Для представления налоговой и бухгалтерской отчетности в электронном виде нужно зайти на страницу: http://nalog.ru/rn77/service/pred_elv/:

Далее необходимо установить Сертификат открытого ключа подписи МИ ФНС России по ЦОД, корневой сертификат ФНС России и список отозванных сертификатов.

Установка открытого ключа ФНС

Для установки сертификата открытого ключа подписи МИ ФНС России по ЦОД нужно его сохранить и запустить установку двойным кликом мыши.

На вкладке «Общие» нажать кнопку «Установить сертификат…»:

Откроется «Мастер импорта сертификатов»:

После нажатия кнопки «Далее» откроется окно выбора хранилища сертификатов.

Необходимо отметить «Автоматически выбрать хранилище на основе типа сертификата», нажать «Далее»:

Для завершения работы «Мастера импорта сертификатов» нажать кнопку «Готово»:

В окне сообщения об успешном импорте сертификата нажать кнопку «ОК»:

Сертификат открытого ключа подписи МИ ФНС России по ЦОД установлен.

Установка корневого сертификата

Для установки корневого сертификата ФНС необходимо перейти по ссылке: http://www.nalog.ru/rn77/about_fts/uc_fns/, скачать корневой сертификат УЦ ФНС России и двойным кликом мыши открыть его, для этого в окне открытия файла нажать кнопку «Открыть»:

На вкладке «Общие» нажать кнопку «Установить сертификат…»:

Откроется «Мастер импорта сертификатов»:

После нажатия кнопки «Далее» откроется окно выбора хранилища сертификатов:

Необходимо выбрать «Поместить все сертификаты в следующее хранилище», нажать кнопку «Обзор» и выбрать хранилище «Доверенные корневые центры сертификации» и нажать «ОК»:

После выбора хранилища сертификатов нажать «Далее»:

Для завершения работы «Мастера импорта сертификатов» нажать кнопку «Готово»:

В окне сообщения об успешном импорте сертификата нажать кнопку «ОК»:

Корневой сертификат установлен.

Установка списка отозванных сертификатов

Для установки списка отзыва нужно сохранить его на компьютер, кликнуть по нему правой кнопкой мыши и выбрать «Установить список отзыва (CRL)». В открывающихся окнах последовательно нажимать «Далее» – «Далее» – «Готово», не меняя настройки по умолчанию.

После установки сертификатов и списка отзыва нажать «Перейти в «Сервис сдачи налоговой и бухгалтерской отчетности».

Ознакомиться с технологией приема и обработки деклараций (расчетов) и перейти к проверке условий, нажав «Проверить выполнение условий»:

Убедиться, что все условия выполнены, и нажать «Выполнить проверки»:

На четвертом шаге проверки будет предложение выбрать цифровой сертификат.

После выбора необходимого сертификата нажать «ОК»:

После проверки сертификата ключа подписи нажать «Начать работу с сервисом»:

В открывшемся окне:

Нужно заполнить пустые поля (Код абонента, КПП) и нажать «Сохранить»:

После сохранения введенных данных перейти в раздел «Загрузка файла»:

Нажать «Обзор» и выбрать контейнер, подготовленный с помощью программы «Налогоплательщик ЮЛ».

После выбора файла нажать кнопку «Отправить».

После передачи файла произойдет автоматический переход на страницу проверки статуса обработки:

После завершения документооборота состояние изменится на «Завершено»:

Посмотреть отправленный файл и историю документооборота можно, перейдя по ссылке в графе «Состояние» – «Завершено (успешно)»:

В «Истории документооборота» можно посмотреть или скачать все регламентные документы.

В дальнейшем можно в любое время зайти в данный сервис (https://service.nalog.ru/nbo/) и просмотреть отправленные ранее декларации (расчеты).

Научно-исследовательский семинар «Электронные сервисы ФНС России в помощь налогоплательщикам»

25 ноября 2016 года кафедрой бухгалтерского учета и аудита технолого-экономического института ФГБОУ ВО СПбГАУ под руководством д.э.н., профессора Бычковой Светланы Михайловны для магистрантов направления «Экономика» профиля «Бухгалтерский учет. Анализ. Аудит» был организован научно-исследовательский семинар на тему «Электронные сервисы ФНС России в помощь налогоплательщикам».

Докладчиком выступила сотрудник межрайонной ИФНС № 2 по Санкт-Петербургу – заместитель начальника отдела камеральных проверок № 3 З.В. Марченко.

В ходе семинара были рассмотрены следующие вопросы:

Электронные сервисы ФНС России для налогоплательщиков – физических лиц
Электронные сервисы ФНС России для налогоплательщиков – юридических лиц.

На семинаре был раскрыт вопрос по взаимодействию налогоплательщиков и налоговых органов с помощью ряда различных электронных сервисов ФНС России, представленных на сайте www.nalog.ru. При этом налогоплательщикам – физическим лицам (ФЛ), юридическим лицам (ЮЛ) и индивидуальным предпринимателям (ИП) могут быть полезны следующие электронные сервисы:

1) Личный кабинет налогоплательщика для физических лиц (ФЛ).

Сервис позволяет получать актуальную информацию о задолженности по налогам перед бюджетом, о суммах начисленных и уплаченных налоговых платежей, об объектах собственности, контролировать состояние расчетов с бюджетом, получать и распечатывать налоговые уведомления и квитанции на уплату налогов, осуществлять оплату, заполнять налоговую декларацию 3-НДФЛ в режиме онлайн, направлять декларацию 3-НДФЛ в налоговый орган, подписанную ЭП налогоплательщика, отслеживать статус камеральной проверки декларации 3-НДФЛ, обращаться в налоговые органы без личного визита.

2) Риски бизнеса: проверь себя и контрагента (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет проявить должную осмотрительность при выборе контрагента (поставщика, подрядчика), предоставляет сведения о государственной регистрации ЮЛ, ИП, крестьянских (фермерских) хозяйств, позволяет осуществлять поиск сведений в реестре дисквалифицированных лиц. Содержит информацию об адресах массовой регистрации; сведения о лицах, в отношении которых факт невозможности участия в организации установлен в судебном порядке, сведения о ЮЛ, отсутствующих по своему юридическому адресу.

3) Онлайн запись на прием в инспекцию (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность всем категориям налогоплательщиков записаться на прием в инспекцию на любую услугу, спланировав визит в инспекцию заранее.

4) Узнай ИНН (ИП, ФЛ).

Сервис позволяет узнать свой идентификационный номер налогоплательщика (ИНН), узнать ИНН физического лица.

5) Письма ФНС России, направленные в адрес территориальных налоговых органов (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис разъясняет налогоплательщикам и сотрудникам территориальных налоговых органов официальную позицию ФНС России о порядке заполнения налоговых деклараций, исчисления и уплаты налогов и сборов, согласованную с Минфином России.

6) Часто задаваемые вопросы (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис содержит базу ответов на самые актуальные вопросы налогоплательщиков: о действующем налоговом законодательстве, о порядке взаимодействия с налоговыми органами федерального, регионального и местного уровней.

7) Обратиться в ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис является средством для обращений физических и юридических лиц в Федеральную налоговую службу. Обращения рассматриваются в соответствии с Федеральным законом от 02.05.2006 № 59-ФЗ «О порядке рассмотрения обращений граждан Российской Федерации»

8) Узнать о жалобе (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность организациям и физическим лицам получать информацию о ходе и результатах рассмотрения обращений (жалоб, заявлений, предложений), поступивших в Федеральную налоговую службу.

9) Решения по жалобам (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет информацию о результатах рассмотрения ФНС России жалоб (обращений) налогоплательщиков за исключением информации, доступ к которой ограничен законодательством Российской Федерации.

10) Нормативные и методические материалы ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис содержит нормативные и методические материалы ФНС России.

11) Анкетирование (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность оценить работу налоговых органов.

12) Почтовая рассылка сайта ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет подписаться на рассылку обновлений сайта ФНС России из интересующего пользователя раздела.

13) Заплати налоги (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет налогоплательщикам формировать платежные документы и осуществлять оплату в режиме онлайн через один из банков-партнеров ФНС России.

14) Представление налоговой и бухгалтерской отчетности в электронном виде (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет направить в налоговый орган налоговую и бухгалтерскую отчетность в электронном виде.

15) Сервис получения идентификатора абонента (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Позволяет всем категориям налогоплательщиков, имеющим сертификат ключа электронной подписи, зарегистрироваться в системе сдачи налоговой и бухгалтерской отчётности по ТКС и получить идентификатор абонента.

16) Федеральная информационная адресная система (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет получить достоверную, единообразную, общедоступную, структурированную адресную информацию по территории Российской Федерации.

17) Доступ к ЕГРЮЛ и ЕГРИП (ИП, ЮЛ).

Сервис предоставляет возможность получения сведений из ЕГРЮЛ и ЕГРИП в электронном виде через Интернет. Начиная с 15 сентября 2015 года в сервисе также реализована возможность использования сведений из ЕГРЮЛ, ЕГРИП в информационных системах заинтересованных юридических и физических лиц

18) Форум сайта ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис представляет собой площадку для обсуждения актуальных вопросов.

19) Узнай ОКТМО (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет определить код ОКТМО по коду ОКАТО или по наименованию муниципального образования.

20) Открытые и общедоступные сведения ЕГРН об иностранных организациях (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предназначен для информирования о состоящих на учете в налоговых органах иностранных организациях либо об отсутствии в ЕГРН сведений о них.

21) Сообщение о клиенте — иностранном налогоплательщике (ЮЛ).

Данный сервис позволяет российской организации финансового рынка в связи с требованиями Федерального закона от 28.06.2014 №173-ФЗ сформировать и направить уведомления о своих клиентах-иностранных налогоплательщиках во все уполномоченные органы по принципу единого окна, а также получать изданные Росфинмониторингом решения о запрете на направление информации в иностранный налоговый орган.

22) Налоговый калькулятор — Расчет стоимости патента (ИП).

Сервис позволяет индивидуальным предпринимателям рассчитать сумму налога, уплачиваемого в связи с применением патентной системы налогообложения.

23) Вакансии (ФЛ).

Сервис предназначен для информирования о вакансиях ФНС России и территориальных налоговых органов.

24) Личный кабинет налогоплательщика юридического лица (ЮЛ).

Сервис позволяет получать актуальную информацию о задолженности по налогам перед бюджетом, о суммах начисленных и уплаченных налоговых платежей, о наличии переплат, невыясненных платежей; контролировать состояние расчетов с бюджетом; составлять и направлять в налоговые органы заявления на уточнение платежа, заявления о зачете/возврате переплаты; получать справки о состоянии расчетов с бюджетом, об исполнении обязанности по уплате налогов и других обязательных платежей, акты сверки.

25) Личный кабинет налогоплательщика индивидуального предпринимателя (ИП).

Сервис позволяет индивидуальному предпринимателю в режиме онлайн контролировать состояние расчетов с бюджетом, взаимодействовать с налоговыми органами в электронном виде, а также подбирать оптимальную систему налогообложения.

26) Единый реестр субъектов малого и среднего предпринимательства (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет доступ к Единому реестру субъектов малого и среднего предпринимательства, позволяет в электронном виде направить в ФНС России дополнительные сведения для внесения в реестр.

27) Подача заявки на государственную регистрацию индивидуальных предпринимателей и юридических лиц (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет ФЛ направить заявку на государственную регистрацию в качестве ИП, на внесение изменений в сведения об ИП, на прекращение деятельности ИП; ЮЛ осуществить подготовку заявления о государственной регистрации при создании юридического лица и направить заявку на государственную регистрацию. При этом наличие ЭП не обязательно.

28) Создай свой бизнес (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис представляет собой пошаговую инструкцию для начинающих предпринимателей: выбор формы регистрации и режима налогообложения, осуществление государственной регистрации, правила применения контрольно-кассовой техники, информация о процедуре проведения налоговых проверок.

29) Подача электронных документов на государственную регистрацию юридических лиц и индивидуальных предпринимателей (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность направить пакет документов в налоговый орган при осуществлении государственной регистрации ЮЛ и ИП. Требуется наличие ЭП и установка специальной программы подготовки пакета документов.

30) Калькулятор транспортного налога ФЛ (ФЛ).

Сервис позволяет физическим лицам рассчитать сумму транспортного налога.

31) Подача заявления физического лица о постановке на учет (ФЛ).

Сервис позволяет: направить в налоговый орган заявление физического лица о постановке на учет (в том числе заверенное ЭП заявителя).

32) Калькулятор земельного налога и налога на имущество физических лиц, исчисляемых исходя из кадастровой стоимости (ФЛ).

Сервис позволяет рассчитать сумму земельного налога и налога на имущество физических лиц исходя из кадастровой стоимости.

33) Адрес и платежные реквизиты Вашей инспекции (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет по заданному адресу узнать номер, адрес и реквизиты налоговой инспекции.

34) Справочная информация о ставках и льготах по имущественным налогам (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет получить информацию по вопросам применения налоговых ставок и льгот по налогу на имущество, транспортному и земельному налогам.

35) Заполнить платежное поручение (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет подготовить платежные документы на перечисление налогов, сборов и иных платежей в бюджетную систему Российской Федерации в электронном виде.

36) Реестр аккредитованных филиалов, представительств иностранных юридических лиц (РАФП) (ЮЛ).

Сервис предоставляет возможность бесплатно получить открытые и общедоступные сведения государственного реестра аккредитованных филиалов, представительств иностранных юридических лиц (РАФП).

37) Уплата госпошлины (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет сформировать платежный документ на уплату госпошлины при регистрации ЮЛ/ИП, за предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП/ЕГРН и реестра дисквалифицированных лиц, а также произвести онлайн оплату через один из банков-партнеров ФНС России.

38) Предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность бесплатно получить сведения из ЕГРЮЛ / ЕГРИП о конкретном юридическом лице / индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа, подписанного электронной подписью. Данный сервис является модернизацией сервиса «Получение выписки из ЕГРЮЛ/ЕГРИП через интернет».

39) Представление сведений об участниках азартных игр, от которых принимаются ставки на официальные спортивные мероприятия (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет организаторам азартных игр в букмекерских конторах и тотализаторах представлять в Федеральную налоговую службу данные учета участников азартных игр, от которых принимаются ставки на официальные спортивные соревнования.

40) ЕАЭС. Заявления о ввозе товаров и уплате косвенных налогов (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет получить информацию о поступлении электронной копии заявления о ввозе товаров и уплате косвенных налогов из налоговых органов страны импортёра (заявителя) в налоговые органы страны-экспортёра Таможенного союза.

41) Проверка корректности заполнения счетов-фактур (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет проверить правильность заполнения идентификационных реквизитов контрагентов в счетах-фактурах. Сервис функционирует в рамках пилотного проекта!

42) Информационные стенды (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет налогоплательщику получить всю информацию, размещенную на информационных стендах территориальных налоговых органов в режиме онлайн, без личного посещения инспекции.

43) Налоговый калькулятор по расчету налоговой нагрузки (ЮЛ).

Региональный сервис позволяет налогоплательщикам Санкт-Петербурга самостоятельно оценить и предупредить налоговые риски.

Также на сайте ФНС России можно узнать информацию о действительных и недействительных свидетельствах о постановке на учет в налоговых органах.

Самым популярным сервисом среди физических лиц является личный кабинет, т.к. с его помощью можно оперативно отслеживать информацию о задолженности по уплате различных налогов, заполнить декларацию для получения налогового вычета и т.д.

В конце семинара присутствующим был представлен видеоролик на тему: «Личный кабинет налогоплательщика для физических лиц». (https://www.nalog.ru/rn78/fl/4816681/).

Вопросы присутствующих:

Как можно устроиться работать в ФНС России?
Можно ли получить пароль для регистрации личного кабинета без явки налоговую инспекцию? Например через портал «Госуслуги»?

Итог семинара: обучающиеся, в том числе магистранты направления «Экономика» профиля «Бухгалтерский учет. Анализ. Аудит», и преподаватели проинформированы о возможностях использования электронных сервисов ФНС России для налогоплательщиков – физических и юридических лиц.

Всего в семинаре приняли участие более 30 слушателей, в том числе 26 магистрантов ФГБОУ ВО СПбГАУ.

Проверка юридического адреса налоговой инспекцией

Действующее законодательство предусматривает, что любое юридическое лицо должно иметь свой юридический адрес, где располагается его исполнительный орган. Данный адрес используется для связи с компанией контрагентами, а также государственными структурами. При выявлении случая недостоверности адреса регистрирующий орган вправе внести в ЕГРЮЛ соответствующую отметку, что в дальнейшем может привести к исключению организации из госреестра. Кроме того, нередко возникают ситуации, когда адрес юрлица признается «массовым». По такому адресу невозможно зарегистрировать юридическое лицо, а для компаний, которые все же имеют подобный адрес — это лишний повод к пристальному вниманию со стороны налоговой. Поэтому для всех участников экономической деятельности очень важно знать, как проверить юридический адрес.

Проверка юридического адреса при регистрации ООО

При регистрации юридического лица его учредители должны предоставить документы, подтверждающие будущее местонахождение. Чаще всего это гарантийное письмо от собственника помещения, где будет располагаться компания. Чтобы исключить возможные неприятности с налоговой, всегда следует выбирать реальный адрес, где организация в дальнейшем будет вести свою деятельность. При этом следует предварительно провести его ]]>проверку]]> на сайте налоговой о том, что он не относится к категории адреса массовой регистрации. Имеет смысл осмотреть само здание, т.к. при регистрации юрлица велика вероятность выезда налоговиков по указанному в документах адресу, а значит, помещение должно быть пригодным для использования в качестве офиса или для производственной деятельности.

Как показывает практика, налоговая служба не пропускает регистрацию юридических адресов, по которым располагаются аварийные здания, инженерные сооружения, некапитальные строения, а также постройки вспомогательного назначения (гаражи, кладовки, сараи).

Читайте также: Государственная регистрация юридических лиц и ИП: изменения 2019

Проверка достоверности адреса юридического лица

Большое значение в современном деловом обороте имеет проверка адреса контрагента. Необходимость проявлять должную осмотрительность при выборе контрагентов и проведении сделок делает вполне обоснованным желание проверить достоверность адреса юридического лица.

Прежде всего, до заключения договора и, тем более, до совершения платежей, необходимо запросить у контрагента реквизиты предприятия, где должен быть указан и его юридический адрес. Его следует сверить с информацией, которая содержится в ЕГРЮЛ, для этого достаточно заказать выписку из реестра или воспользоваться специальным ]]>сервисом]]> на сайте ФНС, предоставляющим информацию о юрлицах в режиме онлайн.

Если адрес совпадает, то есть смысл проверить, насколько он реален. Сначала можно провести удаленную проверку с помощью различных ресурсов, например, посмотреть на карте в интернете, что это за здание и какие организации в нем размещаются. После этого остается только выехать на место и проверить, что по данному адресу действительно располагается нужное юридическое лицо.

Комплекс указанных мер вполне достаточен, чтобы установить достоверность юридического адреса юридического лица и избежать в дальнейшем множества проблем от невозможности найти контрагента, задолжавшего деньги за товар, до начисления дополнительной суммы НДС из-за нерадивого поставщика и не проявленной должной осмотрительности.

Читайте также: Юридический и фактический адрес

Проверка юридического адреса налоговой инспекцией

Еще одной стороной, заинтересованной в достоверности информации о юридическом лице, является налоговая служба. С ужесточением законодательства инспекторами ИФНС проверка юридического адреса проводится при регистрации в большинстве случаев. И довольно часто такая проверка становится основанием для отказа в регистрации юрлица. Поэтому учредителям компаний следует знать, как налоговая проверяет юридический адрес, чтобы заранее принять меры к устранению возможных проблем.

В процессе регистрации нового юридического лица налоговые органы проводят проверку о наличии адреса, указанного в документах, а также проверяют согласие собственника помещения на его предоставление. Далее же следует выездная проверка юридического адреса (пп. «г» п. 4.2 ст. 9 закона от 08.08.2001 № 129-ФЗ о госрегистрации). Тут возможны два варианта:

До завершения процесса регистрации – осуществляется крайне редко при серьезных подозрениях относительно места нахождения, участников, руководителя;
После регистрации – в течение первой недели после регистрации юрлица. В настоящее время осуществляется в большинстве случаев.

Проверка налоговой юридического адреса предусматривает осмотр помещения и оценку его соответствия требованиям к месту нахождения юрлица. В отношении зарегистрированных организаций обязательно проверяется наличие договора аренды, либо иного документа, подтверждающего права пользования. Проверяются и косвенные признаки нахождения организации: наличие рабочих мест, вывески, документов, визиток с адресом. Реальность юрадреса означает, что там находится хотя бы один представитель компании, а также на него приходит корреспонденция, адресованная юрлицу.

Отметим, что налоговые органы вправе осуществить и выездную проверку юрадреса, который соответствует месту жительства руководителя. В этом случае проверяются правоустанавливающие документы на жилое помещение, а также утоняется согласие других лиц, зарегистрированных в данном жилом помещении.

Если в результате проверки налоговиками будет зафиксирован факт отсутствия юридического лица по указанному адресу, то в отношении данной организации в ЕГРЮЛ будет внесена отметка о недостоверности сведений, которая может стать причиной исключения компании из госреестра по инициативе ИФНС.

Читайте также: Как обжаловать запись в ЕГРЮЛ о недостоверности

Информация межрайонной налоговой инспекции №29 ФНС по Свердловской области — Информация государственных учреждений — Главная — официальный сайт Городской округ ЗАТО Уральский Свердловской области

Начальник инспекции: Елькина Элита Николаевна

Почтовый адрес: 624260, Свердловская область, г.Асбест, ул.Комсомольская, 7

— приемная: 8(34365)7-64-99

— отдел учета и работы с налогоплательщиками 8(34365)9-36-07

Телефон Единого Контакт-Центра ФНС России 8-800-222-22-22

р.п Белоярский, ул.Юбилейная, 1

г.Заречный, ул.Комсомольская, 4

Информация ФНС 2021 год

Межрайонная ИФНС России № 29 по Свердловской области в связи с проведением Декларационной кампании 2021 года информирует об адресах и времени приема налоговых деклараций, о размещении консультационных пунктов, телефонах горячей линии

Прием деклараций осуществляется по адресам:

г. Асбест, ул.Комсомольская, 7, операционный зал, окна № 5, № 6,

График работы: понедельник, среда: с 9-00 до 18-00,

вторник, четверг: с 9-00 до 20-00,

пятница с 9-00 до 17-00.

п. Белоярский, ул.Юбилейная,1, операционный зал, окна № 2, № 3

График работы: понедельник-четверг с 9-00 до 18-00,

пятница с 9-00 до 17-00.

Перерыв: с 13-00 до 13-48.

г. Заречный, ул. Алещенкова, 1, операционный зал, окна № 1, № 2

График работы: понедельник-четверг с 9-00 до 18-00,

пятница с 9-00 до 17-00.

Перерыв: с 13-00 до 13-48.

Консультационный пункт организован в здании инспекции, по адресам:

г. Асбест, ул. Комсомольская, 7,

кабинет № 10

График работы: понедельник, среда: с 9-00 до 18-00,

вторник, четверг: с 9-00 до 18-00,

пятница с 9-00 до 17-00,

операционный зал, окно № 2

вторник, четверг: с 18-00 до 20-00.

п. Белоярский, ул.Юбилейная,1, операционный зал, окна № 2, № 3

График работы: понедельник-четверг с 9-00 до 18-00,

пятница с 9-00 до 17-00.

Перерыв: с 13-00 до 13-48.

г. Заречный, ул. Алещенкова, 1, операционный зал, окна № 1, № 2

График работы: понедельник-четверг с 9-00 до 18-00,

пятница с 9-00 до 17-00.

Перерыв: с 13-00 до 13-48.

Телефоны горячей линии, выделенные для информирования по вопросам декларирования доходов физическими лицами:

(34365) 9-36-30 – по вопросам обязанности декларирования доходов,

(34365) 9-36-39 – по вопросам предоставления имущественных и социальных налоговых вычетов,

(34365) 9-36-34; (34377) 7-40-99 — по порядку представления деклараций

Межрайонная инспекция ФНС России № 29 по Свердловской области

18 марта 2021 года

проводит горячую линию на тему «Порядок исчисления и срок уплаты транспортного налога физических лиц. Порядок предоставления налоговых льгот».

По телефону 8 (34365) 9-36-24

с 10.00 до 13.00

на вопросы ответит заместитель начальника отдела камеральных проверок № 2 Федякова Виктория Валентиновна.

УВАЖАЕМЫЕ

НАЛОГОПЛАТЕЛЬЩИКИ!

24 марта 2021 года Межрайонной ИФНС России № 29 по Свердловской области проводится горячая линия на тему «Декларационная кампания-2021: обязанность по представлению декларации 3-НДФЛ, срок её представления».

По телефону

8 (34365) 9-36-14

с 10.00 до 12.00

на вопросы ответит начальник отдела камеральных проверок № 2

Холоменюк Людмила Ивановна

Межрайонная инспекция ФНС России № 29 по Свердловской области

25 марта 2021 года

проводит горячую линию на тему

«Порядок исчисления и срок уплаты земельного налога физических лиц. Порядок предоставления налоговых льгот».

По телефону

8 (34365) 9-36-24

с 10.00 до 13.00

на вопросы ответит

заместитель начальника отдела камеральных проверок № 2

Федякова Виктория Валентиновна.

31 марта 2021 года Межрайонной ИФНС России № 29 по Свердловской области проводится горячая линия на тему «Декларационная кампания 2021. Порядок предоставления вычетов по налогу на доходы физических лиц».

По телефону

8 (34365) 9-36-30

с 10.00 до 12.00

на вопросы ответит государственный налоговый инспектор отдела камеральных проверок № 2

Мещерякова Татьяна Александровна

Межрайонная ИФНС России №29 по Свердловской области приглашает принять участие в вебинаре по теме:

«Актуальные вопросы применения ККТ. Административная ответственность за неприменение ККТ. Представление налоговой декларации по ф. 3-НДФЛ через Личный кабинет.»

25 марта 2021 года в 14:30.

Спикеры: Бугаенко Ольга Владимировна — начальник отдела оперативного контроля,

Кретова Ольга Анатольевна — заместитель начальника отдела учета и работы с налогоплательщиками.

Для участия в мероприятии необходимо предварительно зарегистрироваться по ссылке: https://talk.skbkontur.ru/ifns6683

Уважаемые налогоплательщики!

Приглашаем принять участие в вебинаре по теме:

«Порядок предоставления налоговых льгот по имущественным налогам физических лиц (налог на имущество, транспортный и земельный налоги). Электронные сервисы на сайте ФНС России «Справочная информация о ставках и льготах по имущественным налогам», «Личный кабинет налогоплательщика для физических лиц»»

29 марта 2021 года в 14:30.

Спикеры: Федякова Виктория Валентиновна — заместитель начальника отдела камеральных проверок № 2,

Кретова Ольга Анатольевна — заместитель начальника отдела учета и работы с налогоплательщиками.

Для участия в мероприятии необходимо предварительно зарегистрироваться по ссылке: https://talk.skbkontur.ru/ifns6683

Уважаемые налогоплательщики!

Приглашаем принять участие в вебинаре по теме:

«Порядок предоставления налоговых льгот по земельному и транспортному налогам юридических лиц. О порядке представления Сообщения о наличии у налогоплательщика-организации транспортных средств и (или) земельных участков, признаваемых объектами налогообложения по соответствующим налогам.

Представление документов на государственную регистрацию ЮЛ, ИП в электронном виде.»

31 марта 2021 года в 14:30.

Спикеры: Федякова Виктория Валентиновна — заместитель начальника отдела камеральных проверок № 2,

Марчукова Татьяна Владимировна — заместитель начальника отдела учета и работы с налогоплательщиками.

Для участия в мероприятии необходимо предварительно зарегистрироваться по ссылке: https://talk.skbkontur.ru/ifns6683

Многодетные родители имеют право на льготы по имущественным налогам

Электронные услуги ФНС России на Едином портале государственных и муниципальных услуг

Изменения по налогу на доходы для налогоплательщиков — физических лиц

Декларационная кампания – 2021: особенности, сроки, проверки

Как стать самозанятым — способы регистрации

О представлении бухгалтерской отчетности в 2021 году только в электронном виде

С 2021 года юридические лица начнут получать сообщения об исчисленных суммах транспортного и земельного налогов

О транспортном налоге в отношении весельных лодок, а также моторных лодок с двигателем мощностью не свыше 5 лошадиных сил

Воспользоваться льготами по имущественным налогам стало проще

Подача жалобы в электронном виде упростит процедуру документооборота с налоговым органом

Декларацию о доходах проще и быстрее направить через «Личный кабинет»

Вебинар 25 марта 2021 года в 14:30 «Актуальные вопросы применения ККТ. Административная ответственность за неприменение ККТ. Представление налоговой декларации по ф. 3-НДФЛ через Личный кабинет.»

О получении услуги по государственной регистрации в электронном виде

О порядке предоставления налоговых льгот организациям по транспортному и земельному налогам за 2020 г

С 1 июля 2021 года получить квалифицированную электронную подпись для юридических лиц, индивидуальных предпринимателей и нотариусов можно будет бесплатно

Регистрация бизнеса в электронном виде

Отчитайтесь о полученных доходах не позднее 30 апреля 2021 года

Организациям необходимо провести сверку сведений, содержащихся в ЕГРН

О порядке получения налоговых льгот по имущественным налогам

Недействующие индивидуальные предприниматели исключаются из ЕГРИП

Льготы организаций по имущественным налогам

О получении документов о государственной регистрации ЮЛ и ИП

О подаче жалобы в налоговые органы в новом формате

Несвоевременная уплата налогов может повлечь принудительное взыскание задолженности

Как юридическим лицам и индивидуальным предпринимателям уточнить код по ОКВЭД

Как получить льготы по имущественным налогам

Единый налоговый платеж – что это и почему это удобно?

Доходы от сдачи имущества в аренду облагаются НДФЛ

Важно, чтобы расчетный документ был заполнен правильно

В Свердловской области изменился порядок подачи заявлений на получение патента на право применения патентной системы налогообложения

Информация ФНС 2020 год

Приглашаем принять участие в вебинаре по теме: «Изменения в налоговом законодательстве с 2021 года: отмена ЕНВД; страховые взносы, НДФЛ. Онлайн-кассы. Электронная регистрация ЮЛ, ИП» 24 декабря 2020 года в 15:30 часов

Горячая линия по ЕНВД

Вы не помните свой пароль от «Личного кабинете» — вам помогут госуслуги

Выбор оптимального налогового режима после отмены ЕНВД

Единый налоговый платеж для физических лиц – это удобно!

Как обжаловать решение налогового органа дистанционно

О представлении отчетности по ТКС

Почему налоги не отображаются на портале Госуслуг

Три дня и 1 процедура на открытие бизнеса

Страховые взносы для предпринимателей в следующем году останутся на прежнем уровне

С 1 января 2021 года прекращает свое действие специальный налоговый режим «Единый налог на вмененный доход для отдельных видов деятельности»

С 01 января 2021 года вносятся изменения в реквизиты казначейских счетов Федерального казначейства и реквизиты счетов, входящих в состав единого казначейского счета

С 1 января 2021 года вся бухгалтерская отчетность предоставляется только в электронном виде

С 25 ноября 2020 года государственная регистрация будет проводиться только по новым формам

Позаботьтесь об уплате налогов близкими людьми

Подать жалобу в налоговую службу можно в электронном виде

Нотариусы и частные адвокаты могут проверить наличие задолженности по страховым взносам в ЛК ФЛ

«Невыясненные» платежи – результат ошибок в заполнении платежных документов

Заплатить налог можно с помощью уникального идентификатора начисления (УИН)

Что делать, если в налоговом уведомлении некорректная информация

Единый налоговый платеж поможет уплатить имущественные налоги вовремя

Граждане обязаны представлять уведомления об открытии (закрытии) счета за рубежом

Для заполнения налоговых деклараций можно воспользоваться специальными программами

Единый налоговый платеж – и об оплате налогов можно забыть

Если льгота по имущественным налогам не учтена

Зачесть переплату по налогам стало проще

Можно вернуть НДФЛ за оплату обучения ребенка

Утверждены новые формы документов, представляемых для государственной регистрации ЮЛ, ИП, КФХ, а также требования к их оформлению

О подаче жалобы в налоговые органы в новом формате

Определены размеры страховых взносов на 2021-2023 годы

Основные изменения в налогообложении имущества физических лиц с 2020 года

Отмена ЕНВД с 2021 года

Расширены возможности и дизайн сервиса «Прозрачный бизнес»

Решить большинство вопросов с налоговыми органами можно онлайн

Самозанятые могут легально заниматься многими видами деятельности без риска получить штраф за незаконное предпринимательство

Обратиться в ФНС можно на Едином портале государственных и муниципальных услуг

Подать жалобу (апелляционную жалобу) и получить по ней решение можно по установленной форме по ТКС

О регистрации в качестве самозанятого

В личном кабинете налогоплательщика размещены налоговые уведомления на уплату имущественных налогов за прошлый год

Альтернативные режимы налогообложения для плательщиков ЕНВД

Единый налоговый платеж – уплата имущественных налогов в срок

О рассылке налоговых уведомлений в 2020 году

О размещении в социальных сетях ложной информации о возврате НДФЛ

Как зарегистрировать и закрыть бизнес, не выходя из дома

Информация для плательщиков страховых взносов

Единый налоговый платеж – это удобно!

Изменились возможности «Личного кабинета для физических лиц»

ИНН теперь можно получить в Личном кабинете налогоплательщика

ИНФОРМАЦИЯ ФНС 2019 год

Образцы доверенностей для ИФНС | Пример доверенностей для налоговой — Контур.Экстерн

В соответствии с приказом ФНС РФ от 31.07.2014 N ММВ-7-6/398@ при представлении налоговой декларации (расчета) в электронной форме по ТКС представителем налогоплательщика документ (копия документа), дающим право на подтверждение достоверности и полноты сведений, указанных в декларации (расчете), предоставляется налоговому органу до направления налоговой декларации (расчета). Копия указанного документа сохраняется в налоговом органе в течение 3-х лет после истечения срока действия.

Потребуется предоставить в ИФНС копию доверенности в бумажном или сканированном виде. Также в системе Контур-Экстерн потребуется заполнить Сообщение о представительстве (см. Особенности отправки налоговой отчетности через уполномоченного представителя).

Предлагаем ознакомиться с примерами доверенностей для следующих случаев:

1. Отчетность подписывается ЭП, выданной на бухгалтера данной организации

2. Отчетность ведется сторонней организацией с указанием ответственного лица, уполномоченного представлять отчетность

3. Отчетность индивидуального предпринимателя ведется другим индивидуальным предпринимателем, причем доверенность заверена нотариально

1. Отчетность подписывается электронной подписью бухгалтера

Такую доверенность следует оформить в случае, когда сертификат ЭП оформлен не на руководителя организации. Например, руководитель ООО «Организация 1» в лице генерального директора Иванова И.И. уполномочивает главного бухгалтера Петрова П.П. представлять интересы в ФНС.

Сохранить образец данной доверенности (ситуация 1)

Такую доверенность следует оформить в случае, когда отчетность Организации 1 ведется сторонней фирмой — Организацией 2. При этом в доверенности явно указывается уполномоченное лицо в Организации 2, имеющее право подписи. Таким образом, сдавать отчетность смогут либо руководитель Организации 2, либо ее уполномоченный представитель, указанный в доверенности.

Сохранить образец данной доверенности (ситуация 2)

3. Отчетность индивидуального предпринимателя представляется другим индивидуальным предпринимателем, доверенность заверена нотариально

Такую доверенность следует оформить в случае, когда отчетность индивидуального предпринимателя Иванова И.И. представляется индивидуальным предпринимателем Сидоровым С.С., причем доверенность заверена нотариально.

Сохранить образец данной доверенности (ситуация 3)

Уже заполненную доверенность можно распечатать из реквизитов плательщика.

Сфингозин-1-фосфатлиаза усиливает активацию IKKε для стимулирования IFN-опосредованного врожденного иммунного ответа на инфекцию вирусом гриппа A

Abstract

Сфингозин-1-фосфат (S1P) лиаза (SPL) является внутриклеточным ферментом, который опосредует деградация биоактивного липида S1P. Ранее мы сообщали, что сверхэкспрессированный SPL проявляет противогриппозную вирусную активность; однако лежащий в основе механизм не полностью понят. В этом исследовании мы демонстрируем, что SPL функционирует как позитивный регулятор IKKε, стимулируя IFN-опосредованные врожденные иммунные ответы против вирусной инфекции.Экзогенная экспрессия SPL ингибировала репликацию вируса гриппа A, что коррелировало с увеличением продукции IFN типа I и стимулированным IFN накоплением гена при инфицировании. Напротив, отсутствие экспрессии SPL привело к повышенной восприимчивости клеток к инфекции вируса гриппа А. В подтверждение этого, SPL-дефицитные клетки были неспособны обеспечить эффективный ответ IFN при стимуляции вирусными РНК гриппа. SPL увеличивал статус активации IKKε и усиливал индуцированное киназой фосфорилирование IRF3 и синтез IFN типа I.Однако некомпетентная к деградации S1P форма SPL также усиливала ответы IFN, предполагая, что функция про-IFN SPL не зависит от S1P. Биохимический анализ показал, что SPL, а также мутантная форма SPL взаимодействует с IKKε. Важно отметить, что когда эндогенный IKKε подавлялся с использованием подхода малой интерферирующей РНК, вирусная активность SPL против вируса гриппа была заметно подавлена. Это указывает на то, что IKKε имеет решающее значение для SPL-опосредованного ингибирования репликации вируса гриппа. Таким образом, результаты иллюстрируют функциональное значение оси SPL – IKKε – IFN во время врожденного иммунитета хозяина против вирусной инфекции.

Введение

IFN-ответ типа I — это первая линия защиты врожденной иммунной системы, которая защищает хозяина от патогенных вирусных инфекций (1, 2). Сильная противовирусная активность IFN типа I, которые включают 13 изотипов IFN-α и один IFN-β, наблюдалась во время инфекций, вызванных многочисленными вирусами, включая грипп (3, 4). Инфекция вируса гриппа индуцирует IFN типа I при восприятии клетками продуктов вирусной РНК (вРНК), в первую очередь с помощью RIG-I, который распознает часть 5’ppp на вРНК гриппа (5-7).После активации RIG-I задействуется нижележащий адаптерный белок MAVS, за которым следует рекрутирование киназ IKKε и TBK1 (8), обе из которых могут фосфорилировать IRF3 и IRF7. Фосфорилированные IRF3 и IRF7 действуют как основные факторы транскрипции, которые управляют выработкой IFN-β и IFN-α4, за которой следует продукция других подтипов IFN-α (9). Связывание IFN с родственным рецептором (IFNAR) запускает активацию сигнального пути JAK – STAT (10), которая завершается индукцией транскрипции множества IFN-стимулированных генов (ISG), включая MX1, ISG15, OAS1, ISG56. , и RIG-I.Продукты ISG действуют согласованно, чтобы ограничить репликацию вирусов, запуская антивирусный статус (11). Важность ответа IFN на вирусную инфекцию подчеркивается тем фактом, что многие патогенные вирусы в определенной степени противодействуют сигнальному пути IFN типа I (4, 12, 13). Однако, несмотря на обширные исследования, регуляторный механизм пути продукции IFN типа I до конца не изучен. Следовательно, важно идентифицировать новые клеточные факторы, которые регулируют синтез IFN типа I, и раскрыть подробный молекулярный режим действия для ответа IFN типа I против микробных инфекций.

Сфингозин-1-фосфат (S1P) лиаза (SPL) — это внутриклеточный фермент, который катализирует необратимое расщепление биоактивного липида S1P на его углероде C2-C3 на побочные продукты (например, гексадеценал и фосфоэтаноламин) (14, 15). Сообщалось, что SPL локализован в эндоплазматическом ретикулуме (ER), а также обнаружен в ассоциированной с митохондриями мембране, которая связана с митохондриями и ER (14, 16, 17). Поскольку S1P представляет собой биоактивный липид (18–20), SPL участвует в различных клеточных процессах и заболеваниях, таких как рак, иммунитет, воспаление и развитие (21–26).Тем не менее, прямая роль SPL в контексте врожденного иммунного ответа на вирусные инфекции не была охарактеризована.

Ранее мы сообщали, что клетки, конститутивно сверхэкспрессирующие SPL, были устойчивы к репликации вируса гриппа A (IAV) (27, 28). В этом исследовании мы охарактеризовали вклад эндогенного SPL в путь продукции IFN типа I, когда рецептор распознавания образов, такой как RIG-I, стимулируется после вирусной инфекции. Мы обнаружили, что эндогенный SPL имеет решающее значение для индукции эффективного ответа IFN при распознавании клетками вРНК гриппа.Что еще более важно, SPL связывается с киназой IKKε, тем самым увеличивая ее активацию и способствуя синтезу IFN типа I. В совокупности наши результаты демонстрируют, что SPL является фактором хозяина, который усиливает ответы IFN типа I во время вирусной инфекции. Кроме того, это исследование определяет взаимосвязь между IKKε и SPL, что обеспечивает механистическое понимание про-IFN активности SPL.

Материалы и методы

Клеточные линии и трансфекция

Клетки 293T и клетки эпителия легких человека A549 культивировали в среде DMEM (Life Technologies), как описано в других источниках (29, 30).Клетки MDCK культивировали в MEM Eagle (Mediatech). Клетки культивировали в инкубаторе CO ₂ при 37 ° C, и все среды были дополнены 10% FBS (HyClone) и пенициллином (100 Ед / мл) / стрептомицином (100 мкг / мл) (Invitrogen). Реагент для трансфекции липофектамина 3000 (Invitrogen) использовали для трансфекции плазмидной ДНК в клетки A549 в 24-луночных планшетах в концентрации 500 нг / мл указанной плазмидной ДНК, следуя протоколам, рекомендованным производителем. Пустые векторные плазмиды использовали для гарантии того, что в каждый образец трансфицировали равные общие количества ДНК.Кроме того, для всех образцов, включая отрицательные контроли, использовали равные количества реагента для трансфекции. Для трансфекции ДНК в клетки 293T использовали реагент для трансфекции LipoD293 (SignaGen Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя в 24- или 6-луночных планшетах. Липофектамин RNAiMAX использовали для трансфекции малых интерферирующих РНК (миРНК) клеток 293T в 24-луночных планшетах. Для экспериментов по восстановлению SPL мы использовали подход временной трансфекции для сверхэкспрессии белка SPL в SPL-дефицитных клетках.Клетки с нокаутом SPL (KO) (2 × 10 ⁵) трансфицировали 0,5 мкг плазмиды, кодирующей SPL или SPL (K353L), и экспрессию SPL подтверждали вестерн-блоттингом.

векторных конструкций ДНК

экспрессионных плазмид млекопитающих, кодирующих конструкции SPL дикого типа (WT), включая pc-hSPL и pc-hSPL-GFP, и ферментативно неактивные мутантные конструкции SPL, включая pc-hSPL (K353L) и pc-hSPL (K353L) -GFP, предоставлены Джули Д. Саба (Исследовательский институт Детской больницы Окленда, Окленд, Калифорния) (31).Последовательности сайта мутации в конструкциях SPL (K353L) были подтверждены секвенированием ДНК в центре ДНК (Университет Миссури). Экспрессионные плазмиды млекопитающих, кодирующие Flag-tagged IKKε, Myc-tagged TBK1, IRF3, Flag-tagged IRF7, и репортерные конструкции люциферазы IFN-α1 / pGL3 и IFN-β / pGL3 использовались ранее (8, 32). Для создания конструкции SPL с меткой гемагглютинина (НА) кодирующая последовательность SPL из pVB003-Flag-hSPL (23) была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием прямого праймера 5′-CGGAATTCGCCCTAGCACAGACCTTCTGAT-3 ‘и обратного праймера 5’-GGGACGTACGCAGTAGTG .Амплифицированные полноразмерные фрагменты ПЦР, кодирующие SPL, обрабатывали EcoRI / KpnI и вставляли в вектор pCMV-HA, расщепленный EcoRI / KpnI, который предоставил доктор Дэвид Пинтель (Университет Миссури). Нуклеотидные последовательности субклонированной полноразмерной HA-меченной конструкции SPL подтверждали секвенированием ДНК.

Вирусы

Вирус гриппа A / WSN / 33 (h2N1) был первоначально предоставлен Йошихиро Каваока (Университет Висконсина-Мэдисон, Мэдисон, Висконсин). Эпителиальные клетки MDCK использовали для амплификации вируса.Исследования вирусной инфекции и титрования проводили, как описано ранее (27, 29, 30). Для исследований инфекции клетки инфицировали IAV в течение 1 ч, а затем инкубировали со средой. Супернатанты, содержащие инфекционные вирусы, собирали для титрования с помощью анализа бляшек на клетках MDCK. Для анализа бляшек с использованием серийных разведений супернатантов культур вирусы адсорбировали на 3 × 10 ⁵ клеток MDCK на миллилитр в течение 1 ч, а затем клетки инкубировали с 2 × Eagle MEM (Life Technologies), смешанными с равной порцией 1% агароза (SeaKem ME Agarose).Клетки фиксировали 25% формалином и окрашивали кристально-фиолетовым через 2–3 дня инкубации для подсчета бляшек, образованных вирусными цитопатическими эффектами.

CRISPR-Cas9, нокаут SPL

293T стабильные клеточные линии, нокаутированные по SPL, были получены трансдукцией с помощью lentiCRISPR v2 (подарок от Feng Zhang, Массачусетский технологический институт, Кембридж, Массачусетс; Addgene Plasmid 52961) (33). Был проведен отбор пуромицина с последующим выделением единичных клеток и клональным размножением.Последовательности-мишени, используемые в качестве направляющих последовательностей РНК, представляли собой 5′-GGTCCCATTGACGAAGATGATGG-3 ‘(экзон 9) и 5′-GCATCACATTACTACACGCCCGG-3’ (экзон 14). Для проверки разрушения открытой рамки считывания гена SGPL1 из клеточных линий экстрагировали геномную ДНК и амплифицировали ПЦР с фланкирующими праймерами для амплификации целевой области. Последовательности праймеров, используемые для ПЦР геномной ДНК, представляют собой 5′-CCCTCACTGTGGGATCACTTC-3 ‘и 5′-AACGGCTAGTCAACAGGAGG-3′ для экзона 9 и 5’-TGACACCCCAAGCATGAGAG-3 ‘и 5’-GATGTCTGTGGCAAAGGGGC для exon-14.Среди клеток KO были выбраны две клеточные линии, которые использовались в этом исследовании на основании потери экспрессии белка SPL. Клетки экзона 9-КО (КО-1), использованные в исследовании, имели делецию 9 и 27 нуклеотидов в каждой хромосоме, а клетки экзона 14-КО (КО-2) имели вставки 1 и 2 нуклеотидов в каждую хромосому.

Вестерн-блоттинг и Abs

Вестерн-блоттинг выполняли, как описано в другом месте (27, 29, 30, 34). Клетки лизировали с использованием 2-кратного буфера для образцов, содержащего 2-ME, и кипятили при 95 ° C в течение 10 мин.Равные количества образцов белка загружали в 12% гель SDS-PAGE с последующим переносом разделенных белков из геля на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Связанные с мембраной антитела детектировали с использованием субстрата ECL (Thermo Scientific). Abs против NP вируса гриппа и M1 были приобретены у Abcam; Ат против вирусов гриппа NS1, M2, актина и SPL были приобретены в Santa Cruz Biotechnology; Ат против человеческого GAPDH, ISG56, RIG-I, p-IRF3 (Ser ³⁹⁶), IRF3, p-IKKε (Ser ¹⁷²), IKKε, p-TBK1 (Ser ¹⁷²), TBK1, Myc tag, GFP, p-STAT1 (Tyr ⁷⁰¹), тег FLAG и тег HA были приобретены у Cell Signaling Technology.Ат против гриппа h2N1 NS2 был приобретен у GenScript. Все представленные данные были повторены как минимум дважды с независимыми экспериментальными настройками.

ПЦР в реальном времени

Общую клеточную РНК (кРНК) экстрагировали с использованием реагента TRI (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя и обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific) для удаления загрязняющей ДНК. Выделенную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных гексамеров (Invitrogen) или прямого праймера NP для амплификации РНК NP с отрицательным смыслом IAV-NP или обратного праймера NP для амплификации РНК NP с положительным смыслом IAV-NP.Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) с использованием ген-специфических праймеров. Были использованы следующие праймеры: человеческий MX1 (5′-GTT TCC GAA GTG GAC ATC GCA-3 ‘и 5′-CTG CAC AGG TTG TTC TCA GC-3′), человеческий ISG15 (5’-CGC AGA TCA CCC AGA AGA TCG-3 ‘и 5′-TTC GTC GCA TTT GTC CAC CA-3′), человеческий OAS-1 (5’-GAT CTC AGA AAT ACC CCA GCC A-3 ‘и 5’-AGC TAC CTC GGA AGC ACC TT -3 ′), IFN-β человека (5′-CGC CGC ATT GAC CAT CTA-3 ′ и 5′-GAC ATT AGC CAG GAG GTT CTC A-3 ′) и IAV NP (5′-TGC TTC CAA TGA AAA CAT GG-3 ‘и 5′-GCC CTC TGT TGA TTG GTG TT-3’).qPCR выполняли с химическим анализом SYBR Green I с использованием системы для ПЦР в реальном времени StepOnePlus. Количества кДНК были нормализованы к соответствующему количеству РНК GAPDH из тех же образцов. Все представленные данные были повторены как минимум дважды с независимыми экспериментальными настройками.

Анализ репортерной люциферазы

Клетки 293T (2 × 10 ⁵) трансфицировали в 24-луночных планшетах плазмидами, запускающими IFN-ответ, такими как IKKε, IRF3 и IRF7, вместе с репортерными плазмидами (50 нг IFN- Репортерная плазмида β / pGL3 или IFN-α1 / pGL3), как указано, вместе с 10 нг pRL-CMV (Promega), кодирующей люциферазу Renilla , в качестве контроля трансфекции в присутствии SPL или пустой векторной контрольной ДНК (CTR).Через 24 часа после трансфекции клетки лизировали в буфере для пассивного лизиса для измерения активности люциферазы Renilla и светлячка с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Величины люминесценции измеряли с использованием мультиметочного ридера Perkin Elmer EnSpire 2300.

Анализ коиммунопреципитации

Клетки 293T (2 × 10 ⁶) в 100-миллиметровых чашках для тканевых культур трансфицировали 5 мкг GFP-SPL (подарок от Dr.Джули Д. Саба, Исследовательский институт Детской больницы Окленда) и контрольный вектор или 5 мкг Flag-IKKε. Через день после трансфекции клетки собирали в 1 мл лизирующего буфера для иммунопреципитации (IP) (Thermo Scientific), содержащего смесь ингибиторов протеаз и PMSF (1 мМ). Лизаты клеток инкубировали с 20 мкл аффинной смолы против DYKDDDDK G1 в течение ночи при вращении при 4 ° C. Для экспериментов с GFP или Myc pull-down простые шарики покрывали анти-GFP или анти-MYC Ab (Cell Signaling Technology), соответственно, и 20 мкл этих шариков инкубировали с клеточными лизатами в течение ночи при вращении при 4 ° C.Для эксперимента по удалению HA 20 мкл аффинной смолы против HA (Pierce) использовали для инкубации с клеточными лизатами. Гранулы трижды интенсивно промывали буфером для лизиса IP для удаления любых неспецифически связанных белков. После последней промывки к шарикам добавляли буфер для образцов, содержащий 2-ME. Лизаты кипятили 10 мин и затем использовали для вестерн-блоттинга. Эксперименты были повторены независимо как минимум дважды с аналогичными результатами.

Конфокальная микроскопия

Клетки 293T помещали на предметные стекла с четырьмя или восемью лунками (Nunc).На следующий день клетки трансфицировали 200 нг каждой из указанных плазмид с использованием реагента для трансфекции LipoD293 (SignaGen Laboratories). Через 1 день после трансфекции клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (Fisher Scientific), а затем пермеабилизировали в 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) в течение 10 минут при комнатной температуре. Образцы блокировали 10% BSA в течение 30 минут с последующей инкубацией в течение ночи с указанными первичными антителами, антителами против Flag (1: 1000) или антителами против GFP (1: 100) в 3% BSA в течение ночи при 4 ° C. .После отмывки образцы инкубировали с конъюгированными с Alexa Fluor 488 антителами против кроличьих IgG (1: 500) или с Alexa Fluor 568-конъюгированными против мышиных IgG (1: 500) (оба от Invitrogen) в течение 2 часов с последующим окрашиванием красителем DRAQ5. (300 нМ; Thermo Scientific) в течение 15 мин при комнатной температуре. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica SPE2 DM5500Q и проанализированы с помощью программного обеспечения LSM Image Browser. Показаны репрезентативные поля; каждое изображение выбиралось из 5–10 полей. Результаты были эквивалентны в повторных экспериментах.

РНК-интерференция

27-мерный дуплекс миРНК, нацеленный на IKKε (si-IKKε), и универсальный скремблированный дуплекс миРНК отрицательного контроля (SCR) Trilencer-27 были приобретены у OriGene и использованы в конечной концентрации 20 нМ для трансфекции клеток 293T с использованием Реагент для трансфекции липофектамина RNAiMAX в соответствии с инструкциями производителя. Дуплекс 27-мерной миРНК, нацеленный на SPL (si-SPL; OriGene), использовали в конечной концентрации 25 нМ для трансфекции клеток 293Т. Клетки собирали через 2 дня после трансфекции миРНК, и нокдаун IKKε и SPL подтверждали вестерн-блоттингом.

Статистический анализ

Все столбцы представляют собой средние значения, столбцы ошибок показывают SEM, а средние значения сравнивались с использованием двунаправленного непарного теста Стьюдента t . Данные представляют два или три независимых экспериментальных повтора.

Результаты

SPL ингибирует репликацию IAV, которая связана с повышенным ответом IFN типа I.

Ранее мы наблюдали, что сверхэкспрессия SPL ингибирует репликацию IAV (27). В этом исследовании мы в основном использовали клеточную линию, которая постоянно сверхэкспрессирует белок SPL.Чтобы определить, является ли длительная постоянная экспрессия SPL существенной для подавления репликации вируса, был проведен эксперимент по временной трансфекции. Как показано на фиг. 1A, временная сверхэкспрессия SPL подавляла экспрессию белков IAV, таких как NS1 и M2, при множественности инфекции (MOI) 1 и 3. Результат предполагает, что SPL проявляет противовирусную активность независимо от того, является ли SPL временно или стабильно сверхэкспрессируется. Для дальнейшего определения роли эндогенного SPL в репликации вируса были созданы SPL-дефицитные клетки с использованием генетического подхода, опосредованного CRISPR / Cas9, как описано в Materials and Methods (33).Мы выбрали две клеточные линии на основе нокаута эндогенного SPL, что подтверждено вестерн-блоттингом (рис. 1B, 1C). SPL-дефицитные клетки (клетки KO-1 и KO-2) пролиферировали с той же скоростью, что и SPL-достаточные клетки WT, без каких-либо заметных дефектов роста клеток (дополнительный рисунок 1). При инфицировании IAV клетки KO-1 и KO-2 проявляли повышенную чувствительность к репликации IAV, о чем свидетельствует сильное повышение уровня структурных и неструктурных белков IAV, таких как NS2, NP, NS1 и M2 (рис.1Б, 1С). Кроме того, мы исследовали роль эндогенного SPL в распространении IAV, сравнивая продукцию инфекционного IAV из WT или SPL-дефицитных клеток. Как показано на фиг. 1D, отсутствие эндогенного SPL значительно увеличивало продукцию IAV через 2 и 3 дня постинфекции (dpi). Эти данные дополнительно подтверждают противовирусную функцию эндогенного SPL.

РИСУНОК 1.

SPL подавляет репликацию вируса гриппа. ( A ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали ДНК, кодирующей CTR или HA-tag-SPL (HA-SPL).Через день клетки были ложно инфицированы (Mock) или инфицированы IAV при MOI 1 или 3. Через 8 hpi клетки собирали для вестерн-блоттинга, чтобы проверить уровни NS1, M2, HA-SPL и GAPDH. . Клетки WT, KO-1 ( B ) и клетки KO-2 (1 × 10 ⁶) ( C ) были инфицированы IAV с MOI 0,1 или были ложно инфицированы. При 1 dpi был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения белков NS2, NP, NS1, M2, SPL и GAPDH. ( D ) Клетки WT или KO-2 (2 × 10 ⁵) были инфицированы IAV при MOI 0.01. Анализ бляшек проводили при 2 и 3 dpi для определения вирусного титра в супернатанте инфицированных клеток. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.

IFN типа I являются основными противовирусными цитокинами, продуцируемыми инфицированными вирусом клетками, и линия клеток с избыточной экспрессией SPL, по-видимому, демонстрирует усиленную передачу сигналов IFN для подавления репликации IAV (27, 35). Далее мы оценили влияние экспрессии SPL на ответы IFN типа I на инфекцию IAV.Временная сверхэкспрессия SPL приводила к значительному увеличению продукции IFN-β через 4 часа после инфицирования (hpi) при измерении с помощью кПЦР (фиг. 2A). Однако при 6 hpi в клетках с избыточной экспрессией SPL наблюдалось небольшое увеличение по сравнению с инфицированными клетками, трансфицированными контрольным вектором, что свидетельствует о временном увеличении синтеза IFN за счет SPL. Поскольку ISG являются основными противовирусными эффекторами ответа IFN типа I, мы измерили степень активации ISG. SPL увеличивал уровень мРНК MX1 примерно в 2 раза (рис.2Б). Кроме того, сверхэкспрессия SPL умеренно увеличивает уровень белка ISG, таких как RIG-I и ISG56 (фиг. 2C). Сообщалось, что эти ISG играют важную противовирусную роль при инфицировании вирусом гриппа (36, 37). Следует отметить, что в ложно инфицированных клетках только SPL не индуцировал ответов IFN, что позволяет предположить, что SPL действует как про-IFN фактор после клеточного восприятия вирусной инфекции (рис. 2A – C). Соответственно, было показано, что SPL подавляет синтез вирусных NP-специфических РНК положительных и отрицательных РНК на 6 hpi (рис.2D, 2E). Кратковременное увеличение продукции IFN SPL на 4 hpi с последующим быстрым снижением на 6 hpi (рис. 2A) может быть связано с меньшим количеством стимулирующих IFN вРНК, присутствующих в клетках со сверхэкспрессией SPL, по сравнению с контрольными клетками (рис. 2D, 2E). Кроме того, мы исследовали ответ IFN типа I во время инфекции IAV в SPL-дефицитных клетках. Было показано, что после инфекции IAV эндогенный SPL имеет решающее значение для эффективной продукции IFN-β (рис. 2F) и ISG, таких как ISG15 (рис. 2G), RIG-I и ISG56 (рис.2H). В совокупности эти данные демонстрируют, что SPL увеличивает продукцию IFN и ISG типа I, что коррелирует со снижением репликации IAV.

РИСУНОК 2.

SPL увеличивает ответ IFN типа I на инфекцию вируса гриппа. ( A и B ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали CTR или SPL. Через 1 день после трансфекции клетки были ложно инфицированы или инфицированы IAV при MOI 0,5. Относительные уровни РНК IFN-β (A) и MX1 (B) рассчитывали с помощью кПЦР при 4 и 6 hpi.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ( C ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали ДНК, кодирующей CTR или HA-tag SPL (HA-SPL). Через день клетки были ложно инфицированы (Mock) или инфицированы IAV при MOI 1 или 3. При 8 hpi клетки собирали для вестерн-блоттинга, чтобы проверить уровни RIG-I, ISG56, HA-SPL, и белки GAPDH. ( D и E ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали CTR или SPL.Через 1 день после трансфекции клетки были ложно инфицированы или инфицированы IAV при MOI 0,5. Относительные уровни отрицательно-смысловой РНК (D) NP IAV и положительно-смысловой РНК (E) NP IAV рассчитывали с помощью кПЦР при 4 и 6 hpi. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ( F ) Клетки WT 293T или клетки KO-2 (2 × 10 ⁵) были ложно инфицированы или инфицированы IAV с MOI 0,01. При 2 dpi относительные уровни IFN-β (F) и ISG15 ( G ) рассчитывали с помощью qPCR.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ( H ) Клетки WT 293T или клетки KO-2 (2 × 10 ⁵) были ложно инфицированы или инфицированы IAV при MOI 0,01. При 2 dpi клетки собирали для Вестерн-блоттинга для проверки уровней белков RIG-I, ISG56, SPL, NS1 и GAPDH. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001. нс , незначительно.

Эндогенный SPL важен для эффективной индукции ответов IFN при клеточной чувствительности к вРНК гриппа

Хотя SPL усиливал ответы IFN во время инфекции IAV, эффект оказался умеренным (рис.2Б, 2С). Это может быть связано с наличием динамического антагонистического взаимодействия между вирусными компонентами и клеточными факторами системы IFN-хозяина во время процесса репликации IAV (30, 38–44). Чтобы преодолеть это, мы выбрали метод, который запускает ответ IFN, отличный от инфекции IAV. Следовательно, вРНК, которые были очищены из инфицированных IAV клеток, использовали для стимуляции продукции IFN. Сообщалось, что трансфекция клеток вРНК гриппа активирует сигнальный путь RIG-I за счет распознавания трифосфатных фрагментов на вРНК, что приводит к индукции IFN типа I (5–7, 45).кРНК выделяли из неинфицированных клеток и использовали в качестве отрицательного контроля. После трансфекции вРНК клетки, дефицитные по эндогенному SPL (клетки KO-1 и KO-2), были намного менее эффективны при синтезе мРНК IFN-β, чем SPL-достаточные клетки WT (фиг. 3A). Снижение продукции IFNs, вызванное дефицитом SPL, привело к снижению активации ISG-специфических мРНК, таких как ISG15 (фиг. 3B) и OAS1 (фиг. 3C). Соответственно, дефицит SPL заметно подавлял экспрессию белков ISG, таких как RIG-I и ISG56 (рис.3D, 3E). В соответствии с этими данными, когда SPL подавлялся siRNA, vRNA-индуцированная экспрессия RIG-I и ISG56 была нарушена (рис. 3F). Эти данные ясно демонстрируют, что эндогенный SPL важен для эффективного продуцирования IFN типа I и продуктов ISG, которые, в свою очередь, могут создавать оптимальные противовирусные условия при распознавании клетками РНК IAV.

РИСУНОК 3.

SPL важен для создания эффективного ответа IFN на клеточное распознавание вРНК гриппа. ( A — C ) Клетки WT 293T, клетки KO-1 или клетки KO-2 (1 × 10 ⁶) трансфицировали РНК, выделенной из инфицированных IAV клеток (вРНК), или РНК, выделенной из неинфицированных клеток. (кРНК) в концентрации 2.5 мкг / мл. Через 1 день после трансфекции относительные уровни мРНК IFN-β (A), ISG15 (B) и OAS1 (C) определяли путем проведения кПЦР и наносили на график как кратную индукцию для образцов, обработанных кРНК. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). Клетки WT 293T, клетки KO-1 ( D ) и клетки KO-2 (1 × 10 ⁶) ( E ) трансфицировали вРНК или кРНК. Через 1 день был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения белков RIG-I, ISG56, SPL и GAPDH. ( F ) Клетки 293T трансфицировали si-SPL или SCR.Через 24 часа после трансфекции клетки трансфицировали вРНК или кРНК в концентрации 1,25 мкг / мл. Через день уровни RIG-I, ISG56, SPL и GAPDH были проанализированы с помощью вестерн-блоттинга. *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001.

SPL взаимодействует с IKKε и усиливает активацию IKKε, что приводит к усилению продукции IFN типа I

IKKε и фосфорилируют TBK1 и активируют IRF3, который функционирует как фактор транскрипции для управления синтезом IFN типа I (8, 9).Чтобы определить молекулярный механизм, лежащий в основе активности про-IFN SPL, мы исследовали, регулирует ли SPL активацию IKKε или TBK1, которая приводит к активации IRF3. Хотя TBK1 был аутофосфорилирован и индуцировал фосфорилирование IRF3, SPL не влиял на уровень аутофосфорилирования TBK1 или TBK1-опосредованного фосфорилирования IRF3 (дополнительный рисунок 2A), что позволяет предположить, что SPL не влияет на TBK1-опосредованные ответы IFN. Напротив, SPL увеличивал уровень активированной формы IKKε (p-IKKε в Ser ¹⁷²) и IKKε-опосредованное фосфорилирование IRF3 (рис.4А). Кроме того, SPL увеличивал уровень p-IKKε дозозависимым образом (фиг. 4B). Эти данные показывают, что SPL способствует активации IKKε, но не TBK1. Для дальнейшего изучения того, регулирует ли SPL активацию IKKε, мы использовали анализ репортера люциферазы для измерения промоторной активности IFN-α / β. Это позволяет нам определить, обладает ли SPL способностью влиять на индуцированный IKKε синтез IFN. Как показано на фиг. 4C, SPL значительно увеличивал опосредованную IKKε активацию промотора IFN-β.Кроме того, SPL стимулировал IKKε-опосредованную активацию промотора IFN-α по сравнению с контролем при стимуляции вместе с IRF3 (фиг. 4D) или IRF7 (фиг. 4E). Однако сверхэкспрессия SPL в отсутствие IKKε не способна индуцировать активацию транскрипции IFN типа I (Fig. 4C-E). Мы дополнительно исследовали функцию SPL в стимулировании активации IKKε с использованием SPL-дефицитных клеток. Как показано на фиг. 4F, дефицит SPL привел к сильному ингибированию аутофосфорилирования IKKε. Соответственно, мы также наблюдали снижение фосфорилирования IRF3 (рис.4F) и продукции IFN-β (рис. 4G) в отсутствие эндогенного SPL. Взятые вместе, эти данные показывают, что SPL усиливает стимуляцию IKKε, что приводит к повышенной активации факторов транскрипции IRF3 и IRF7, которые в конечном итоге усиливают синтез IFN-α / β.

РИСУНОК 4.

SPL увеличивает активацию IKKε для усиления IKKε-опосредованной индукции IFN. ( A ) Клетки 293T (2 × 10 ⁵) трансфицировали возрастающими дозами экспрессионной плазмиды IKKε (+, 5 нг; ++, 25 нг; +++, 125 нг) в присутствии 200 нг Плазмида IRF3 или пустая векторная контрольная плазмида (-) в присутствии 200 нг плазмиды SPL или пустая векторная контрольная плазмида (-), как указано.Через 10 ч клетки собирали и проводили вестерн-блоттинг для обнаружения p-IKKε, IKKε, p-IRF3, IRF3 и GAPDH. ( B ) Клетки 293T (1 × 10 ⁶) трансфицировали 25 нг IKKε с возрастающими дозами плазмиды SPL (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 или 1 мкг). Через десять часов был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения p-IKKε, IKKε, SPL или GAPDH. Показаны блоты SPL с короткой (SE) и длинной (LE) экспозицией. ( C ) Клетки 293T трансфицировали 50 нг репортерной плазмиды IFN-β вместе с 10 нг плазмиды IKKε в присутствии SPL или CTR.Через 1 день после трансфекции проводили анализ люциферазы. Клетки 293T трансфицировали 100 нг репортерной плазмиды IFN-α1 вместе с 10 нг IKKε и IRF3 ( D ) или 10 нг IKKε и IRF7 ( E ) в присутствии 250 нг SPL или CTR. Через 1 день после трансфекции клетки собирали и проводили анализ люциферазы. Показаны относительные значения люциферазы. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ( F ) Клетки WT 293T или клетки SPL KO-2 (2 × 10 ⁵) трансфицировали 50 нг плазмиды экспрессии IKKε или пустой векторной контрольной плазмиды (-).Тридцать два часа спустя был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения p-IKKε, IKKε, p-IRF3, IRF3 и GAPDH. ( G ) Клетки WT 293T или клетки SPL KO-2 (2 × 10 ⁵) трансфицировали 50 нг плазмиды экспрессии IKKε или пустой векторной контрольной плазмиды (0 ч). Спустя 24 часа относительные уровни мРНК IFN-β определяли с помощью кПЦР. Результаты представлены как кратность индукции IFN-β в образцах WT и KO-2 по сравнению со значением для каждого образца, трансфицированного пустой векторной контрольной плазмидой (0 ч).Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001. нс , незначительно.

Для дальнейшего изучения механизма действия, лежащего в основе SPL-опосредованной активации IKKε, мы проверили возможное взаимодействие между SPL и IKKε. Co-IP был выполнен, при этом IKKε был снижен, и была оценена способность SPL соосаждаться во фракции IP. Данные, представленные на фиг. 5A, продемонстрировали, что SPL, меченный GFP, взаимодействует с IKKε, тогда как сам GFP не связывается с IKKε.Взаимодействие между SPL и IKKε было подтверждено выполнением обратного co-IP (т.е. снятие SPL с последующим обнаружением IKKε в иммунопреципитированной фракции) (фиг. 5B). Однако SPL не связывался с близкородственной киназой TBK1 (Supplemental Fig. 2B, 2C). Кроме того, мы использовали конфокальную микроскопию для визуализации паттернов локализации SPL и IKKε. Сообщалось, что SPL локализован в цитоплазматических органеллах, таких как ER (17, 31). IKKε обнаружил диффузную картину локализации по всей цитоплазме (рис.5C, Flag-IKKε). Интересно, что когда SPL и IKKε были коэкспрессированы, значительная часть IKKε перераспределялась в точечные структуры в цитозоле, где SPL был колокализован (Рис. 5C, GFP-SPL + Flag-IKKε). Однако IKKε не подвергался перераспределению этого типа при совместной экспрессии с GFP (фиг. 5C, GFP + Flag-IKKε), который использовали в качестве отрицательного контроля. Эти результаты привели нас к выводу, что SPL взаимодействует с IKKε, что может способствовать активации IKKε за счет повышения статуса фосфорилирования IKKε.Поскольку мы использовали слитый белок GFP-SPL в вышеупомянутых биохимических анализах ко-IP и конфокальной микроскопии, мы также протестировали функцию GFP-SPL, чтобы убедиться, что GFP-SPL остается функциональным и отображает тот же фенотип, что и немаркированный SPL. . Было доказано, что GFP-SPL усиливает аутофосфорилирование IKKε, аналогично немаркированному SPL, тогда как белок GFP не влияет на фосфорилирование IKKε (фиг. 6A). В подтверждение этого наблюдения, GFP-SPL, но не GFP, увеличивал продукцию IFN-β при инфекции IAV (рис.6Б).

РИСУНОК 5.

SPL взаимодействует с IKKε. ( A ) Клетки 293T трансфицировали с помощью Flag-tagged IKKε (Flag-IKKε) в присутствии GFP-tagged SPL (GFP-SPL) или GFP-экспрессирующей плазмиды (GFP), или пустым контрольным флаговым вектором (-) . Через 24 часа после трансфекции проводили co-IP с использованием аффинной смолы против FLAG и проводили вестерн-блоттинг для обнаружения Flag-IKKε, GFP-SPL и GFP во фракциях с пониженным содержанием (IP: FLAG) и в лизаты целых клеток (Вход). ( B ) Клетки 293T трансфицировали Flag-IKKε в присутствии пустого контрольного вектора (-) или HA-SPL.Через 24 часа проводили совместную ИП с использованием аффинной смолы, покрытой анти-НА. Вестерн-блоттинг проводился для обнаружения Flag-IKKε и HA-SPL во фракции «pull-down» (IP: HA), а также в лизатах целых клеток (вход). ( C ) Flag-IKKε и GFP-SPL трансфицировали отдельно или котрансфицировали в клетки 293T. Flag-IKKε и GFP-экспрессирующую плазмиду (GFP) котрансфицировали в клетки (GFP + Flag-IKKε) в качестве отрицательного контроля. Через 24 ч после трансфекции клетки окрашивали DRAQ5 для обнаружения ядер, которые показаны на объединенных изображениях, и Ab против Flag (α-Flag) для обнаружения IKKε и Ab против GFP (α-GFP) для обнаружения SPL конфокальным методом. микроскопия.Поля на крайних левых панелях увеличены, чтобы показать детали. Стрелки указывают на точечную структуру. Показаны репрезентативные конфокальные изображения. Шкала 10 мкм.

РИСУНОК 6. Слияние

GFP не нарушает функцию SPL в усилении активации IKKε и продукции IFN. ( A ) Клетки 293T (1 × 10 ⁶) трансфицировали 25 нг IKKε в присутствии 0,2 или 0,8 мкг плазмиды SPL (SPL), меченной GFP плазмиды SPL (GFP-SPL) или GFP. -экспрессирующая плазмида (GFP).Через десять часов был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения p-IKKε, Flag-IKKε, SPL, GFP и GAPDH. ( B ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали CTR, GFP или GFP-SPL. Через 1 день после трансфекции клетки были ложно инфицированы или инфицированы IAV при MOI 0,5. Относительные уровни РНК IFN-β рассчитывали с помощью кПЦР при 6 hpi. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ** p ≤ 0,01. нс , незначительно.

IKKε важен для противовирусного эффекта, проявляемого SPL при инфекции IAV.

Затем мы попытались установить функциональную значимость оси SPL – IKKε во время инфекции IAV.С этой целью мы подавляли эндогенный IKKε, используя подход siRNA в присутствии или в отсутствие SPL, при инфекции IAV. Как и ожидалось, SPL проявлял противовирусный эффект в клетках, обработанных SCR (фиг. 7A), и подавлял синтез вирусных белков M1 и NP. Однако этот противовирусный эффект SPL был почти отменен, когда эндогенный IKKε был подавлен (фиг. 7A). Это наблюдение указывает на важность IKKε в опосредовании противовирусного эффекта, проявляемого SPL. Чтобы дополнительно подтвердить, наблюдается ли аналогичный эффект при продуцировании инфекционных вирусов, мы провели анализ бляшек с использованием супернатанта инфицированных клеток.В поддержку результатов, основанных на экспрессии вирусного белка, подавление IKKε сводило на нет способность SPL подавлять продукцию инфекционного IAV (фиг. 7B). Кроме того, мы повторили эксперимент с нокдауном IKKε с использованием клеток A549, чтобы подтвердить наши результаты. Противовирусный эффект SPL также отменялся, когда эндогенный IKKε был подавлен в клетках A549 (фиг. 7C). Кроме того, было обнаружено, что SPL индуцирует фосфорилирование IKKε на расстоянии 6 hpi, что должно было способствовать противовирусной функции SPL. Когда IKKε подавлялась с помощью миРНК, эта фосфорилированная фракция IKKε не появлялась (рис.7C), что подтверждает результат о том, что SPL действует на активацию IKKε, подавляя репликацию IAV. Взятые вместе, наши данные дополнительно демонстрируют, что противовирусная активность SPL зависит от IKKε.

РИСУНОК 7.

IKKε имеет решающее значение для противовирусной функции SPL во время инфекции IAV. ( A ) Клетки SPL KO-1 (2 × 10 ⁵) трансфицировали si-IKKε или SCR в присутствии SPL или CTR. Трансфицированные клетки инфицировали IAV при MOI 0,1. При 1 dpi проводили вестерн-блоттинг для обнаружения M1, NP, IKKε, HA-SPL и GAPDH.( B ) Клетки КО-2 (2 × 10 ⁵) трансфицировали si-IKKε или SCR в присутствии SPL или CTR. Трансфицированные клетки инфицировали IAV при MOI 0,1. Через 24 часа на дюйм супернатанты клеток MDCK собирали для количественного определения вирусных титров с помощью анализа бляшек. Для каждого состояния использовали три отдельных образца инфицированных вирусом клеток на группу. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3 на группу). ( C ) Клетки A549 (2 × 10 ⁵) трансфицировали si-IKKε или SCR в присутствии SPL или CTR.Трансфицированные клетки инфицировали IAV при MOI 0,5. При 6 hpi был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения p-IKKε, IKKε, HA-SPL и GAPDH; при 18 hpi был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения вирусных M1, NP и GAPDH. ** p ≤ 0,01. нс , незначительно.

SPL усиливает ответы IFN типа I независимо от его ферментативной активности

Ферментативная функция SPL заключается в расщеплении внутриклеточного S1P. Таким образом, мы исследовали, необходима ли S1P-метаболизирующая активность SPL для того, чтобы SPL выполнял свою функцию про-IFN.Чтобы проверить это, в наших экспериментах мы использовали мутантную форму SPL, SPL (K353L), которая не может разрушать S1P из-за точечной мутации в его сайте связывания кофактора (31). Интересно, что SPL (K353L) проявлял аналогичную противовирусную активность, что и SPL WT, в отношении ингибирования репликации IAV в SPL-дефицитных клетках (фиг. 8A). Таким образом, способность SPL нарушать репликацию IAV, по-видимому, не зависит от его способности разрушать внутриклеточный S1P. Затем мы исследовали, способен ли мутантный SPL увеличивать стимуляцию IKKε.Как показано на фиг. 8B, SPL (K353L) может увеличивать активацию IKKε дозозависимым образом, подобно WT SPL (фиг. 4B). В соответствии с этими данными, эксперименты по ко-IP показали, что мутантный SPL также может связываться с IKKε (фиг. 8C, 8D). Эти данные в совокупности указывают на то, что SPL действует как про-IFN-фактор независимо от его ферментативной активности по разложению клеточного S1P.

РИСУНОК 8.

SPL усиливает ответ IFN типа I независимо от его ферментативной активности. ( A ) Клетки WT 293T или клетки KO-1 (2 × 10 ⁵) трансфицировали CTR, WT SPL или мутантным SPL [SPL (K353L)], как указано.Через день трансфицированные клетки инфицировали IAV при MOI 0,1. Вестерн-блоттинг выполняли с разрешением 1 dpi для обнаружения белков NS2, NS1, SPL и GAPDH. ( B ) Клетки 293T (1 × 10 ⁶) трансфицировали 25 нг Flag-tagged IKKε с возрастающими дозами (0,4, 0,6, 0,8 или 1 мкг) плазмиды SPL (K353L). Через десять часов после трансфекции проводили вестерн-блоттинг для обнаружения белков p-IKKε, IKKε, SPL и GAPDH. ( C ) Клетки 293T трансфицировали GFP-меченным SPL (K353L) [GFP-SPL (K353L)] и либо пустым контрольным вектором Flag (-), либо меченным флагом IKKε (Flag-IKKε).Через двадцать четыре часа после трансфекции проводили IP с использованием аффинной смолы против FLAG и проводили вестерн-блоттинг для обнаружения Flag-IKKε и GFP-SPL (K353L) во фракциях с пониженным содержанием (IP: FLAG) и в целом. -клеточные лизаты (Вход). ( D ) Клетки 293T трансфицировали Flag-IKKε в присутствии пустого контрольного вектора (-) или GFP-SPL (K535L). Через 24 часа проводили совместную ИП с использованием аффинной смолы, покрытой анти-GFP. Был проведен вестерн-блоттинг для обнаружения Flag-IKKε и GFP-SPL (K353L) в вытесняющей фракции (IP: GFP), а также в лизатах цельных клеток (вход).

Обсуждение

В этом исследовании мы демонстрируем, что SPL имеет решающее значение для врожденного иммунитета хозяина, способствуя эффективному ответу IFN типа I и установлению антивирусного состояния. Механически SPL увеличивает продукцию IFN путем связывания и активации киназы IKKε, которая фосфорилирует IRF3. Мы очерчиваем взаимосвязь между SPL и IKKε и их взаимодействие для стимулирования продукции IFN-α / β.

Известно, что

IKKε и TBK1 активируют факторы транскрипции IRF3 / IRF7 для индукции IFN типа I (8).Однако общность и различия между этими двумя киназами в отношении их активности в пути продукции IFN до конца не изучены. Хотя TBK1 конститутивно экспрессируется в большинстве типов клеток, IKKε чаще обнаруживается в иммунных клетках, и его экспрессия часто повышается при стимуляции LPS или воспалительными цитокинами (46). Кроме того, исследования, проведенные с TBK1-дефицитными и IKKε-дефицитными эмбриональными фибробластами мыши (MEF), установили избыточную роль IKKε и TBK1 в ответе IFN на лечение полиинозиновой полицитидиловой кислотой, тогда как IKKε играли незаменимую роль в продукции IFN при лечении LPS. (47).Интересно, что MEF с дефицитом TBK1 все еще могут вызывать IFN-ответ на лечение полиинозиновой-полицитидиловой кислотой, что было отменено в IKKε ^{— / —} TBK1 ^{— / —} MEF с двойным дефицитом, что указывает на то, что IKKε действительно играет определяющую роль в IFN. производство (47). Таким образом, функция IKKε может больше зависеть от типа стимула или состояния клетки. Наши результаты показывают, что SPL регулирует IKKε, но не TBK1. Дифференциальный эффект, который SPL оказывает на активацию TBK1 и IKKε, дополнительно подтверждается нашими данными co-IP, которые предоставляют механистические доказательства того, что SPL действительно связывается с IKKε, но не с TBK1.Определение углубленного механизма SPL-опосредованной специфической регуляции IKKε может расширить наше понимание дифференциальных функций IKKε и TBK1 в управлении синтезом IFN типа I.

При анализе конфокальной микроскопии мы наблюдали, что IKKε перемещается в точечные цитоплазматические тельца (Fig. 5C). Природа этих цитоплазматических тел остается неизвестной. Пунктатоподобная структура IKKε также наблюдалась, когда IKKε коэкспрессировался с другим IKKε-связывающим белком, TRIM6 (48).Было высказано предположение, что IKKε перемещается в тельца, богатые TRIM6-ubiquitin, для усиления активации IKKε. Следовательно, вероятно, что IKKε собирается с образованием точечно-подобной структуры, когда он связывается с другими клеточными белками для активации передачи сигналов IFN. Будет интересно исследовать, участвует ли TRIM6 в SPL-опосредованной регуляции активности и / или локализации IKKε. Кроме того, остается неизвестным, что заставляет SPL взаимодействовать с IKKε. Мы наблюдали, что уровень экспрессии SPL не изменяется при стимуляции IFN.Однако существует вероятность того, что при восприятии клетками вРНК SPL претерпевает посттрансляционную модификацию. После модификации SPL может действовать как про-IFN-фактор, взаимодействуя с IKKε. Альтернативно, после клеточного распознавания вРНК, активированные IKKε могут рекрутировать SPL в путь IFN. Эти возможности в настоящее время исследуются.

Сообщается, что вирус гриппа пытается противодействовать мощному противовирусному ответу IFN (49, 50). Например, было показано, что NS1 вируса гриппа множеством способов противодействует системе IFN типа I (6, 49).Однако остается неизвестным, регулируют ли белки IAV, такие как NS1, функцию про-IFN SPL или SPL модулирует действие вирусного белка против IFN. Определение молекулярного механизма, лежащего в основе этой динамической регуляции, поможет нам понять пути взаимодействия IAV с хозяином.

Мыши IKKε ^{— / —} были сверхчувствительны к инфекции гриппа с повышенными титрами вируса в легких по сравнению с контрольными мышами WT (51). Также было показано, что респираторно-синцитиальный вирус и вирус везикулярного стоматита индуцируют экспрессию и / или активацию IKKε, что способствует активации IRF3 в ответ на эти инфекции (52, 53).Кроме того, сообщалось, что белок VP35 вируса Эбола и нуклеопротеин вируса лимфоцитарного хориоменингита взаимодействуют с IKKε, чтобы предотвратить его связывание с IRF3, тем самым противодействуя клеточному ответу IFN (54, 55). Таким образом, IKKε является ключевым игроком в вызове врожденного иммунного ответа в контексте множественных вирусных инфекций. Используя подход IKKε-knockdown, мы окончательно продемонстрировали важность IKKε в SPL-опосредованном противогриппозном вирусном действии (рис. 7). Наше исследование, связывающее SPL с IKKε и ответ IFN типа I, может быть экстраполировано на другие патогенные вирусные инфекции, для которых значение IKKε в жизненном цикле вируса уже установлено.

Наши данные предполагают, что мутантный SPL может проявлять противовирусный потенциал в той же степени, что и WT SPL во время инфекции IAV. Эти данные показывают, что активность SPL по разложению S1P не является необходимой для его про-IFN функции. Это согласуется с предыдущим наблюдением, что аналоги сфингозина или агонист S1P рецептора 1 (S1P ₁ R) не влияли на репликацию вируса гриппа in vitro и in vivo (27, 28, 56-58). Белок-белковое взаимодействие между SPL и IKKε, по-видимому, является важным и достаточным для SPL, чтобы увеличить активацию IKKε, чтобы способствовать IFN-ответу I типа.Однако аналоги сфингозина или агонист S1P ₁ R могут регулировать цитокиновые ответы во время инфицирования вирусом гриппа (56-59). Также недавно сообщалось, что агонист S1P ₁ R или экзогенный S1P может напрямую индуцировать деградацию рецептора IFN типа I (IFNAR), чтобы ингибировать амплификацию IFN на плазматических дендритных клетках (60). Это может быть важным механизмом регуляции воспалительного ответа, учитывая, что S1P, как было показано, влияет на цитокиновые / хемокиновые ответы в различных условиях (61–63).Вероятно, SPL может вызывать деградацию S1P, чтобы предотвратить опосредованную S1P ₁ R деградацию IFNAR1, тем самым приводя к сохранению интактного пути IFN. Однако регуляция внутриклеточного SPL может приводить к измененным физиологическим условиям, отличным от экзогенной стимуляции S1P ₁ R. Кроме того, наши данные показывают, что фенотипическое и функциональное взаимодействие между SPL и IKKε не требует ферментативной активности SPL. Возможно, клеточное обнаружение вРНК направляет действие SPL на IKKε-опосредованный путь IFN типа I в инфицированных вирусом клетках.Таким образом, можно предположить, что SPL играет двойную роль в регуляции иммунных ответов хозяина посредством S1P-зависимых и S1P-независимых механизмов. Сложные механизмы взаимодействий сфинголипидная система-иммунитет хозяина нуждаются в дальнейшем изучении с использованием различных систем, включая регуляцию S1P-метаболизирующих ферментов, а также активацию S1PR.

Сообщалось, что мыши SPL-KO не выживают более 2–3 недель после рождения (64). Совсем недавно были разработаны условные мыши SPL-KO, которые могут быть использованы для изучения функции SPL, специфичной для определенного типа клеток, in vivo (65).Исследование функции SPL на модели мышей позволит нам определить важность SPL во время инфекции IAV in vivo. Более того, роль SPL в первичных респираторных эпителиальных клетках человека или иммунных клетках еще предстоит определить.

IFN типа I представляют собой клеточные факторы, которые имеют решающее значение для врожденного иммунного ответа хозяина против большинства вирусных инфекций. Следовательно, понимание точного механизма событий передачи сигнала, способствующих созданию этой защитной системы, окажет большое влияние на область вирусной иммунологии и инфекционных заболеваний.Что еще более важно, исследования оси SPL-IKKε-IFN могут расширить наши знания о взаимодействиях вирус-хозяин и иммунорегуляторных путях, что также имеет трансляционный потенциал для разработки новых терапевтических вмешательств для лечения вирусных инфекций.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джули Саба (Исследовательский институт Детской больницы Окленда) за любезное предоставление плазмид SPL и Дэвида Пинтела (Университет Миссури) за предоставление плазмиды pCMV-HA.Мы также благодарим Грега Ламберта и Майкла Болдуина (Университет Миссури) за помощь в конфокальной микроскопии.

Footnotes

Эта работа была поддержана грантом R01AI091797 Национального института здравоохранения / Национальным институтом инфекционных заболеваний (для B.H.) и грантом Национального института здравоохранения R01AI108861 (для J.H.) и GM110776 (для M.C.J.).
Онлайн-версия этой статьи содержит дополнительные материалы.
Аббревиатуры, использованные в этой статье:
кРНК
клеточная РНК
CTR
пустой вектор контрольная ДНК
dpi
день постинфекции
ER
эндоплазма
час постинфекции
IAV
вирус гриппа A
IP
иммунопреципитация
ISG
IFN-стимулированный ген
KO
нокаут
MEF
9035 множественная инфекция мыши Множество
Множественная инфекция MEF
кПЦР
количественная ПЦР
SCR
Trilencer-27 Универсальный скремблированный дуплекс миРНК отрицательного контроля
si-IKKε
дуплекс миРНК, направленный на IKKε
siRNA
siRNA
siRNA siRNA
siRNA
SPL
SPL
9 0357 S1P-лиаза
S1P
сфингозин-1-фосфат
S1P ₁ R
S1P рецептор 1
вРНК
вирусная РНК
WT
дикого типа.

Получено 17 ноября 2016 г.
Принято 12 мая 2017 г.

20. Лазер Х.М., Пинто А.К., Фогт М.Р., Гейл М. мл. Алмазный МС: бета-интерферон

контролирует вирусную инфекцию Западного Нила и патогенез у мышей.J Virol. 2011;

85 (14): 7186–94. https://doi.org/10.1128/JVI.00396-11.

21. Даффис С., Сутар М.С., Шреттер К.Дж., Гейл М-младший, Даймонд М.С. Индукция IFN-

бета и врожденный противовирусный ответ в миелоидных клетках происходит через

IPS-1-зависимый сигнал, который не требует IRF-3 и IRF-7. PLoS Pathog.

2009; 5 (10): e1000607. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000607.

22. Lazear HM, Lancaster A, Wilkins C, Suthar MS, Huang A, Vick SC и др.IRF-3,

IRF-5 и IRF-7 координированно регулируют ответ IFN типа I в дендритных клетках миелоидных

ниже по ходу передачи сигналов MAVS. PLoS Pathog. 2013; 9 (1):

e1003118. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003118.

23. Цай М. Х., Пай Л. М., Ли С. К.. Тонкая настройка интерферонового ответа типа I с помощью STAT3.

Front Immunol. 2019; 10: 1448. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01448.

24. Уэхата Т., Такеучи О. Распознавание РНК и иммунитет — врожденный иммунитет

зондирование и механизмы его посттранскрипционной регуляции.Ячейки. 2020; 9 (7).

https://doi.org/10.3390/cells

01.

25. Пинто А. К., Даффис С., Брайен Д. Д., Гейни М. Д., Йокояма В. М., Шихан К. С. и др.

временная роль передачи сигналов интерферона типа I в созревании CD8 + Т-клеток

во время острой инфекции вируса Западного Нила. PLoS Pathog. 2011; 7 (12): e1002407.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002407.

26. Шреттер К.Дж., Брайен Д.Д., Текрей Л.Б., Вирджин Х.В., Крессвелл П., Даймонд М.С. Интерферон-индуцируемый ген

виперин ограничивает патогенез вируса Западного Нила.J

Вирол. 2011. 85 (22): 11557–66. https://doi.org/10.1128/JVI.05519-11.

27. Шреттер К.Дж., Дэниэлс Б.П., Чо Х., Гейни М.Д., Йокояма В.М., Гейл М.-младший и др.

2’-O-метилирование кэпа вирусной мРНК вирусом Западного Нила позволяет избежать ifit1-

-зависимых и независимых механизмов ограничения хозяина in vivo. ПЛоС

Патог. 2012; 8 (5): e1002698. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002698.

28. Линдквист Р., Мундт Ф., Гилторп Дж. Д., Вольфель С., Гекара Н. О., Крогер А. и др.Быстрый ответ интерферона

типа I защищает астроциты от флавивирусной инфекции и цитопатических эффектов, вызванных вирусом

. J Нейровоспаление. 2016; 13 (1): 277.

https://doi.org/10.1186/s12974-016-0748-7.

29. Лукас TM, Ричнер Дж. М., Diamond MS. Стимулированный интерфероном ген Ifi27l2a

ограничивает инфекцию и патогенез вируса Западного Нила в зависимости от типа клеток и региона

. J Virol. 2015; 90 (5): 2600–15. https://doi.org/10.1128/

ОВИ.02463-15.

30. Хан Ю.В., Чой Дж.Й., Уянгаа Э., Ким С.Б., Ким Дж.Х., Ким Б.С. и др. Четкое определение

нейровоспаления, вызванного вирусом японского энцефалита, и летальности через

, запускающее сигнальные пути TLR3 и TLR4. PLoS Pathog. 2014; 10 (9):

e1004319. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004319.

31. Ким С.Б., Чой Дж.Й., Ким Дж.Х., Уянгаа Э., Патил А.М., Парк С.И. и др. Улучшение

японского энцефалита за счет блокирования передачи сигналов 4-1BB связано с

дивергентным усилением ответов IFN типа I / II и дифференцировкой Ly-6C (hi) моноцитов

.J Нейровоспаление. 2015; 12 (1): 216. https://doi.org/10.1186/

s12974-015-0438-х.

32. Ким С.Б., Чой Дж.Й., Уянгаа Э., Патил А.М., Хоссейн Ф.М., Хур Дж. И др. Блокирование

индоламин-2,3-диоксигеназы регулирует японский энцефалит посредством усиления

врожденных и адаптивных Т-клеточных ответов IFN типа I / II. J

Нейровоспаление. 2016; 13 (1): 79. https://doi.org/10.1186/s12974-016-0551-5.

33. Линь Р.Дж., Ляо К.Л., Линь Е., Линь Ю.Л. Блокирование индуцированного альфа-интерфероном сигнального пути Jak-

Stat инфекцией вируса японского энцефалита.J Virol. 2004;

78 (17): 9285–94. https://doi.org/10.1128/JVI.78.17.9285-9294.2004.

34. Линь Р.Дж., Чанг Б.Л., Ю Х.П., Ляо К.Л., Линь Ю.Л. Блокирование индуцированной интерфероном передачи сигналов Jak-

Stat вирусом японского энцефалита NS5 через механизм, опосредованный фосфатазой протеин-тирозин

. J Virol. 2006. 80 (12): 5908–18. https: // doi.

орг / 10.1128 / JVI.02714-05.

35. Йе Дж, Чен З, Ли Й, Чжао З, Хе В., Зохайб А. и др. Вирус японского энцефалита

NS5 подавляет продукцию интерферона I типа (IFN), блокируя ядерную транслокацию

регуляторного фактора 3 IFN и NF-kappaB.J Virol. 2017; 91 (8).

https://doi.org/10.1128/JVI.00039-17.

36. Zhou D, Li Q, Jia F, Zhang L, Wan S, Li Y, et al. NS1’белок вируса японского энцефалита

подавляет продукцию IFN типа I, воздействуя на MAVS. J

Immunol. 2020; 204 (5): 1287–98. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1

37. Чо Х, Пролл С.К., Шреттер К.Дж., Катце М.Г., Гейл М-младший, Даймонд МС. Дифференциальный

программ врожденного иммунного ответа в подтипах нейронов определяют

восприимчивость к инфекции в головном мозге вирусами с положительной цепью РНК.Nat

Med. 2013. 19 (4): 458–64. https://doi.org/10.1038/nm.3108.

38. Schoggins JW, Wilson SJ, Panis M, Murphy MY, Jones CT, Bieniasz P, et al.

разнообразных генных продуктов являются эффекторами противовирусного ответа интерферона

типа I. Природа. 2011. 472 (7344): 481–5. https://doi.org/10.1038/nature09907.

39. Уянгаа Е., Ким Дж. Х., Патил А. М., Чой Дж. Й., Ким С. Б., Эо С. К.. Определенная восходящая роль

передачи сигналов IFN типа I в происходящих из гемопоэтических стволовых клеток и эпителиальных

резидентных клетках для согласованного рекрутирования моноцитов Ly-6Chi и NK-клеток

через каскад CCL2-CCL3.PLoS Pathog. 2015; 11 (11): e1005256. https: // doi.

org / 10.1371 / journal.ppat.1005256.

40. Джордж Дж. А., Парк СО, Чой Дж. Й., Уянгаа Е., Эо СК. Двусторонний эффект

CD4 (+) Foxp3 (+) регуляторных Т-клеток, размноженных острой инфекцией денге через путь

TLR2 / MyD88. Eur J Immunol. 2020; 50 (7): 1000–18. https://doi.org/1

0.1002 / eji.201948420.

41. Макартни К.К., Баумгарт, округ Колумбия, Кардинг С.Р., Брубейкер Дж. О., Оффит, Пенсильвания. Первичные

эпителиальных клеток тонкого кишечника мышей, поддерживаемые в долгосрочной культуре, являются

чувствительными к ротавирусной инфекции.J Virol. 2000. 74 (12): 5597–603. https: // doi.

org / 10.1128 / JVI.74.12.5597-5603.2000.

42. Лю С., Штольц Д. Б., Саппингтон П. Л., Масиас К. А., Киллин М. Е., Тенхунен Дж. Дж. И др.

HMGB1 секретируется иммуностимулированными энтероцитами и способствует гиперпроницаемости монослоев Caco-2, индуцированной цитомиксом

. Am J Phys Cell

Phys. 2006; 290 (4): C990–9. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00308.2005.

43. Li WC, Ralphs KL, Tosh D. Выделение и культивирование гепатоцитов взрослых мышей.

Методы Mol Biol. 2010; 633: 185–96. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-01

9-5_13.

44. Bridges BC, Hardison D, Pietsch J. Серия случаев успешного использования

ЭКМО, непрерывной заместительной почечной терапии и обмена плазмы

при полиорганной недостаточности, связанной с тромбоцитопенией. J

Pediatr Surg. 2013. 48 (5): 1114–7. https://doi.org/10.1016/j.jpedsurg.2013.

02.061.

45. Латимер Г., Корриво С., ДеБиази Р.Л., Янтауш Б., Делани М., Жако С. и др.

Сердечная дисфункция и полиорганная болезнь, связанная с тромбоцитопенией

Фенотип воспаления, вызванного недостаточностью, в тяжелом педиатрическом случае COVID-19.

Ланцет для здоровья детей и подростков. 2020; 4 (7): 552–4. https://doi.org/10.1016/S23

52-4642 (20) 30163-2.

46. Арем Р. Гипогликемия, связанная с почечной недостаточностью. Endocrinol Metab Clin

N Am. 1989. 18 (1): 103–21. https://doi.org/10.1016/S0889-8529(18)30391-8.

47. Нейлор Дж. М., Кронфельд Д. С..Исследования in vivo гипогликемии и лактоацидоза

при эндотоксическом шоке. Am J Phys. 1985; 248 (3 Pt 1): E309–16. https://doi.org/1

0.1152 / ajpendo.1985.248.3.E309.

48. Харгроув Д.М., Бэгби Г.Дж., Ланг С.Х., Спитцер Дж.Дж. Доза адренергической блокады

не отменяет повышенный оборот глюкозы при бактериальной инфекции. Am J Phys.

1988; 254 (1, часть 1): E16–22. https://doi.org/10.1152/ajpendo.1988.254.1.E16.

49. Майтра С.Р., Гестринг М.Л., Эль-Маграби М.Р., Ланг С.Х., Генри М.К.Эндотоксин-

индуцировал изменения активности глюкозо-6-фосфатазы в печени и экспрессии гена

. Mol Cell Biochem. 1999. 196 (1/2): 79–83. https://doi.org/10.1

023 / A: 1006970229704.

50. Srikiatkhachorn A, Spiropoulou CF. Сосудистые события при вирусных геморрагических лихорадках

: сравнительное исследование денге и хантавирусов. Cell Tissue Res.

2014; 355 (3): 621–33. https://doi.org/10.1007/s00441-014-1841-9.

51. Chao CH, Wu WC, Lai YC, Tsai PJ, Perng GC, Lin YS, et al.Вирус денге

Неструктурный белок 1

активирует тромбоциты через Toll-подобный рецептор 4, что приводит к

тромбоцитопении и кровотечению. PLoS Pathog. 2019; 15 (4): e1007625.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007625.

52. de Mast Q, de Groot PG. Серотонин — ключ к тромбоцитопении при лихорадке денге?

Кровь. 2019; 133 (21): 2249–50. https://doi.org/10.1182/blood-2019-03-

53. Чантик С., Саттитептумронг А, Раварак Н, Паттанакитсакул С.Н.

Участие трансцитоза в транспортной системе и проницаемость эндотелия

утечки из сосудов во время инфицирования вирусом денге. Вирусы. 2018; 10 (2).

https://doi.org/10.3390/v10020069.

54. Phanthanawiboon S, Limkittikul K, Sakai Y, Takakura N, Saijo M, Kurosu T.

Острая системная инфекция вирусом денге приводит к утечке сосудов и

смерти из-за фактора некроза опухоли альфа и передачи сигналов Tie2 / ангиопоэтина

у мышей, лишенных рецепторов интерферона I и II типов.PLoS One. 2016; 11 (2):

e0148564. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148564.

55. Дейли С., Роллинз Б.Дж. Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (CCL2) в

воспалительных заболеваниях и адаптивном иммунитете: терапевтические возможности и

противоречий. Микроциркуляция. 2003. 10 (3-4): 247–57. https://doi.org/10.1080/

mic.10.3-4.247.257.

56. Satpathy AT, Wu X, Albring JC, Murphy KM. Повторное (де) финирование дендритных клеток

линии. Nat Immunol.2012. 13 (12): 1145–54. https://doi.org/10.1038/ni.2467.

57. Итальяни П., Бораски Д. От моноцитов к макрофагам M1 / M2:

фенотипическая дифференциация против функциональной. Фронт Иммунол. 2014; 5: 514.

58. Рансохофф Р.М., Браун М.А. Врожденный иммунитет центральной нервной системы. J

Clin Invest. 2012. 122 (4): 1164–71. https://doi.org/10.1172/JCI58644.

59. Терри Р.Л., Геттс Д.Р., Деффраснес К., ван Вреден С., Кэмпбелл, Иллинойс, Кинг, штат Нью-Джерси.

Воспалительные моноциты и патогенез вирусного энцефалита.J

Нейровоспаление. 2012; 9: 270.

Patil et al. Журнал нейровоспаления (2021) 18: 136 Стр. 25 из 26

Содержимое любезно предоставлено Springer Nature, применяются условия использования. Права защищены.

К сожалению, запрашиваемая страница не найдена.

Мы записали эту ошибку (404), чтобы помочь нам исправить проблему.
Вы можете попробовать еще раз, используя один из инструментов ниже.

	Вернуться на предыдущую страницу
	Карта сайта
	Индекс продукта
	Индекс загрузки программного обеспечения
	Чтобы найти для вашей страницы, попробуйте нашу функцию поиска.

AllTechnology NetworkPartnerNetwork (только общедоступная) Видео и мультимедиа

Уточнить поиск


	RSS \| Юридические уведомления и условия использования \| Заявление о конфиденциальности

МФС России No.35 в Москве

Инспекция Федеральной налоговой службы № 35 по г. Москве (Налоговая инспекция 7735) принадлежит Управлению Федеральной налоговой службы по г. Москве и расположена в г. Зеленограде на ул. Юность, 5. Налоговая инспекция № 35 обслуживает ЗАО. регионов и работает с физическими и юридическими лицами по вопросам подачи налоговых деклараций, исчисления и уплаты налогов, предоставления выписок из реестра / ЕГРИП, порядка применения ЕКТ.

Адрес ФНС №35 по г. Москве

Индекс ИФНС 7735 в Москве:

124482

Физический адрес ИФНС 7735 в Москве:

г. Москва, г. Зеленоград, ул. Юность, д., 5

Ближайшие станции метро к налоговой инспекции 7735 в Москве:

Метро Речной вокзал, метро Митино

Как добраться до ИФНС 7735 в Москве:

От метро «Речной вокзал»: автобус. 400 до остановки «Студент».
От Ленинградского вокзала: до ст. Крюково, далее авт. 10.12 до остановки «Студент»
Метро «Митино» автобус 400 (красный) до остановки «Поликлиника», перейти дорогу, далее автобус. 19 до остановки «Студент»

Телефоны IFNS 7735 в Москве:

приемная начальника инспекции: +7 (495) 400-00-35

Телефон доверия: +7 (495) 400-29-95

Телефон доверия по вопросам использования ККТ: +7 (495) 400-14-96

Реквизиты ФНС 35 по г. Москве

Официальное наименование налоговой инспекции:

Инспекция ФНС России №35 для города Москвы

Налоговый кодекс:

Налоговый кодекс: 7735

Код ОКПО: 292

Код RO YUL / IP: 77066

ИНН / КПП налоговая инспекция:

7735071603/773501001

Платежные реквизиты налоговой инспекции:

Управление Федерального казначейства по г. Москве (Инспекция ФНС России № 35 по г. Москве)

Наименование банка: Государственный банк России в ЦФО

БИК банка: 044525000

Номер счета: 40101810045250010041

Структура ИФНС 35 в Москве

Начальники налоговой инспекции 7735 по Москве:

Руководитель: Антонова Елена Николаевна

Заместители руководителя: Марных Ольга Валерьевна., Костина Светлана Андреевна, Сафронова Нина Ивановна

Отделения ИФНС 7735 в Москве:

Отдел по работе с налогоплательщиками, тел.: +7 (495) 400-29-93
Отдел камеральных проверок №4, тел.: +7 (495) 400-29-86
Отдел камеральных проверок №2, тел .: +7 (495) 400-30-04

Время работы ИФС 35 в Москве

Часы проверки:

Понедельник — четверг: с 9-00 до 18-00

Пятница: с 9-00 до 16-45

Перерыв: с 13-00 до 13-45

Время работы операционной:

Понедельник, Среда: с 9-00 до 18-00

вторник, четверг: с 9-00 до 20-00

Пятница: с 9-00 до 16-45

Суббота (2 и 4 числа каждого месяца): с 10-00 до 15-00

Перерыв: нет

Выдача выписок из Учреждения / ЕГРИП: с 15-00 до окончания работы

Обслуживаемые адреса по ИФНС 35 в Москве

р-н Крюково, Матушкино, Силино, Савекки, Старое Крюково, ЗЕЛАО города Москвы.

Чтобы определить, принадлежит ли адрес регистрации лица 35 Инспекции Федеральной налоговой службы по Москве, необходимо проверить его на официальном сайте ФНС http://service.nalog.ru/addrno .do

Коды ОКТМО участков, принадлежащих ФНС 35 по г. Москве:

Крюково — 45330000, Матушкино — 45331000, Силино — 45332000, Савельки — 45377000, Старое Крюково — 45927000

Для проверки и обновления кода ОКТМО необходимо проверить адрес регистрации человека на официальном сайте Федеральной налоговой службы (http: // fias.nalog.ru/)

Официальный сайт ФНС 35 по Москве

www.nalog.ru/rn77/ifns/imns77_35/

Официальный сайт Федеральной налоговой службы 35 Зеленоград

% PDF-1.6 % 696 0 объект > эндобдж 713 0 объект > эндобдж 794 0 объект > поток Acrobat Distiller 8.0.0 (Windows) PScript5.dll Версия 5.22015-09-18T10: 30: 32 + 09: 002015-09-15T19: 17: 40 + 09: 002015-09-18T10: 30: 32 + 09: 00application / pdf

<30362D3230313520C1A4B1E2C7D0BCFAB4EBC8B82DC6F7BDBAC5CDC3CAB7CFC1FD2E687770>

xpuser

uuid: 70698246-7371-4bb4-9f85-9dfb3920ca14uuid: e21f89b4-3327-4d23-b557-3c840c10ab84 конечный поток эндобдж 790 0 объект > / Кодировка >>>>> эндобдж 670 0 объект > эндобдж 671 0 объект > эндобдж 682 0 объект > эндобдж 683 0 объект > эндобдж 684 0 объект > эндобдж 685 0 объект > эндобдж 686 0 объект > эндобдж 687 0 объект > эндобдж 688 0 объект > эндобдж 689 0 объект > эндобдж 690 0 объект > эндобдж 691 0 объект > эндобдж 692 0 объект > эндобдж 572 0 объект > эндобдж 579 0 объект > эндобдж 581 0 объект > поток h ޤ Yob \ {

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 7 0 объект /Заголовок /Тема / Автор /Режиссер / Ключевые слова / CreationDate (D: 20210930012425-00’00 ‘) / ModDate (D: 2021012

30 + 01’00 ‘) >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 6 0 obj > транслировать

Сара Майе

конечный поток эндобдж 8 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 16 0 объект > эндобдж 17 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 38 0 объект > эндобдж 39 0 объект > эндобдж 40 0 объект > эндобдж 41 0 объект > эндобдж 42 0 объект > эндобдж 43 0 объект > эндобдж 44 0 объект > эндобдж 45 0 объект > эндобдж 46 0 объект > эндобдж 47 0 объект > эндобдж 48 0 объект > эндобдж 49 0 объект > эндобдж 50 0 объект > эндобдж 51 0 объект > эндобдж 52 0 объект > эндобдж 53 0 объект > эндобдж 54 0 объект > эндобдж 55 0 объект > эндобдж 56 0 объект > эндобдж 57 0 объект > эндобдж 58 0 объект > эндобдж 59 0 объект > эндобдж 60 0 объект > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 62 0 объект > эндобдж 63 0 объект > эндобдж 64 0 объект > эндобдж 65 0 объект > эндобдж 66 0 объект > эндобдж 67 0 объект > эндобдж 68 0 объект > эндобдж 69 0 объект > эндобдж 70 0 объект > эндобдж 71 0 объект > эндобдж 72 0 объект > эндобдж 73 0 объект > эндобдж 74 0 объект > эндобдж 75 0 объект > эндобдж 76 0 объект > эндобдж 77 0 объект > эндобдж 78 0 объект > эндобдж 79 0 объект > эндобдж 80 0 объект > эндобдж 81 0 объект > эндобдж 82 0 объект > эндобдж 83 0 объект > эндобдж 84 0 объект > эндобдж 85 0 объект > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 87 0 объект > эндобдж 88 0 объект > эндобдж 89 0 объект > эндобдж 90 0 объект > эндобдж 91 0 объект > эндобдж 92 0 объект > эндобдж 93 0 объект > эндобдж 94 0 объект > эндобдж 95 0 объект > эндобдж 96 0 объект > эндобдж 97 0 объект > эндобдж 98 0 объект > эндобдж 99 0 объект > эндобдж 100 0 объект > эндобдж 101 0 объект > эндобдж 102 0 объект > эндобдж 103 0 объект > эндобдж 104 0 объект > эндобдж 105 0 объект > эндобдж 106 0 объект > эндобдж 107 0 объект > эндобдж 108 0 объект > эндобдж 109 0 объект > эндобдж 110 0 объект > эндобдж 111 0 объект > эндобдж 112 0 объект > эндобдж 113 0 объект > эндобдж 114 0 объект > эндобдж 115 0 объект > эндобдж 116 0 объект > эндобдж 117 0 объект > эндобдж 118 0 объект > эндобдж 119 0 объект > эндобдж 120 0 объект > эндобдж 121 0 объект > эндобдж 122 0 объект > эндобдж 123 0 объект > эндобдж 124 0 объект > эндобдж 125 0 объект > эндобдж 126 0 объект > эндобдж 127 0 объект > эндобдж 128 0 объект > эндобдж 129 0 объект > эндобдж 130 0 объект > эндобдж 131 0 объект > эндобдж 132 0 объект > эндобдж 133 0 объект > эндобдж 134 0 объект > эндобдж 135 0 объект > эндобдж 136 0 объект > эндобдж 137 0 объект > эндобдж 138 0 объект > эндобдж 139 0 объект > эндобдж 140 0 объект > эндобдж 141 0 объект > эндобдж 142 0 объект > эндобдж 143 0 объект > эндобдж 144 0 объект > эндобдж 145 0 объект > эндобдж 146 0 объект > эндобдж 147 0 объект > эндобдж 148 0 объект > эндобдж 149 0 объект > эндобдж 150 0 объект > эндобдж 151 0 объект > эндобдж 152 0 объект > эндобдж 153 0 объект > эндобдж 154 0 объект > эндобдж 155 0 объект > эндобдж 156 0 объект > эндобдж 157 0 объект > эндобдж 158 0 объект > эндобдж 159 0 объект > эндобдж 160 0 объект > эндобдж 161 0 объект > эндобдж 162 0 объект > эндобдж 163 0 объект > эндобдж 164 0 объект > эндобдж 165 0 объект > эндобдж 166 0 объект > эндобдж 167 0 объект > эндобдж 168 0 объект > эндобдж 169 0 объект > эндобдж 170 0 объект > эндобдж 171 0 объект > эндобдж 172 0 объект > эндобдж 173 0 объект > эндобдж 174 0 объект > эндобдж 175 0 объект > эндобдж 176 0 объект > эндобдж 177 0 объект > эндобдж 178 0 объект > эндобдж 179 0 объект > эндобдж 180 0 объект > эндобдж 181 0 объект > эндобдж 182 0 объект > эндобдж 183 0 объект > эндобдж 184 0 объект > эндобдж 185 0 объект > эндобдж 186 0 объект > эндобдж 187 0 объект > эндобдж 188 0 объект > эндобдж 189 0 объект > эндобдж 190 0 объект > эндобдж 191 0 объект > эндобдж 192 0 объект > эндобдж 193 0 объект > эндобдж 194 0 объект > эндобдж 195 0 объект > эндобдж 196 0 объект > эндобдж 197 0 объект > эндобдж 198 0 объект > эндобдж 199 0 объект > эндобдж 200 0 объект > эндобдж 201 0 объект > эндобдж 202 0 объект > эндобдж 203 0 объект > эндобдж 204 0 объект > эндобдж 205 0 объект > эндобдж 206 0 объект > эндобдж 207 0 объект > эндобдж 208 0 объект > эндобдж 209 0 объект > эндобдж 210 0 объект > эндобдж 211 0 объект > эндобдж 212 0 объект > эндобдж 213 0 объект > эндобдж 214 0 объект > эндобдж 215 0 объект > эндобдж 216 0 объект > эндобдж 217 0 объект > эндобдж 218 0 объект > эндобдж 219 0 объект > эндобдж 220 0 объект > эндобдж 221 0 объект > эндобдж 222 0 объект > эндобдж 223 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageB / ImageI] >> эндобдж 224 0 объект > транслировать x ڝ Xn # 7 +!;! Ȃ6oA4 = Ecfzmq dXr / ~ ki [\ 0> $ X6Zq9EL, ZZw6o6 | g4 & U) Xk33> 8.xr7
(& Zl = I @> gjEQz / [bDPĀmc22 | n} 8I \ + fX5V’0;: Z S 6 \ C «ܨ Wq {mQ2; {~ vL ~ 9% Mv4] D> P’9OGW.gȫDIRdH8I #} 8y4D3 * 1OP ֖ uUi» D8IyP AHPɪ9
Весенняя конференция 2011 — Общество общей микробиологии
Стр. 2: Сессии Весеннее собрание 11-14 апреля
Стр. 5 и 6: Обратите внимание: тезисы публикуются
Стр. 7 и 8: Обратите внимание: тезисы публикуются
Стр. 9 и 10: Обратите внимание: Тезисы опубликованы
Стр. 11 и 12: Обратите внимание: Тезисы опубликованы
Стр. 13 и 14: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Стр. 15 и 16: Обратите внимание: Тезисы publishe
Page 17 и 18: Обратите внимание: аннотации опубликованы
Page 19 и 20: Обратите внимание: аннотации опубликованы
Page 21 и 22: Обратите внимание: аннотации опубликованы
Page 23 и 24: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 25 и 26: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 27 и 28: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 29 и 30: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 31 и 3 2: Обратите внимание: тезисы публикуются
Страница 33 и 34: Обратите внимание: тезисы публикуются
Страница 35 и 36: Обратите внимание: тезисы публикуются
Страница 37 и 38: Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 39 и 40: Обратите внимание: аннотации публикуются
Страница 41 и 42: Обратите внимание: рефераты публикуются
Стр. 43 и 44: Обратите внимание: рефераты публикуются
Стр. 45 и 46: Обратите внимание: рефераты публикуются
Страница 47 и 48: Обратите внимание: Тезисы опубликованы
Страница 49 и 50: Обратите внимание: Тезисы опубликованы
Страница 51 и 52: Обратите внимание: Тезисы опубликованы
Страница 53 и 54:
Обратите внимание: Тезисы are publishe
Page 55 и 56:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 57 и 58:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 59 и 60:
Обратите внимание: аннотации публикуются 90 005
Страница 61 и 62:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 63 и 64:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 65 и 66:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 67 и 68:
Обратите внимание: тезисы публикуются
стр. 69 и 70:
Обратите внимание: тезисы публикуются
стр. 71 и 72:
Обратите внимание: тезисы публикуются
стр. 73 и 74:
Пожалуйста Примечание: Тезисы публикуются
Страница 75 и 76:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 77 и 78:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 79 и 80:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 81 и 82:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 83 и 84:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 85 и 86:
Обратите внимание : Тезисы публикуются
Страница 87 и 88:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 89 и 90:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 91 и 92:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 93 и 94:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 95 и 96:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 97 и 98:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 99 и 100:
Обратите внимание: аннотации публикуются
страница 101 и 102:
Обратите внимание: рефераты публикуются
страница 103 и 104:
Обратите внимание: рефераты публикуются
страница 105 и 106:
Обратите внимание : Тезисы публикуются
Страница 107 и 108:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 109 и 110:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
90 343 Стр. 111 и 112:
Обратите внимание: аннотации публикуются

Стр. 113 и 114:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Стр. 115 и 116:
Обратите внимание: Рефераты публикуются
Стр. 117 и 118 :
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 119 и 120:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 121 и 122:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 123 и 124:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 125 и 126:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 127 и 128:
Обратите внимание: Тезисы публикуются
Страница 129 и 130:
Обратите внимание: Тезисы публикуются 6
9034
Page 131 и 132:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 133 и 134:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 135 и 136:
Пожалуйста, обратите внимание: аннотации публикуются
Page 137 и 138:
Обратите внимание: рефераты публикуются
Page 139 и 140:
Обратите внимание: рефераты публикуются
Page 141 и 142:
Обратите внимание: аннотации publishe
Page 143 и 144:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 145 и 146:
Обратите внимание: рефераты публикуются
Page 147 и 148:
Примечание: аннотации публикуются 6
149 и 150:
Обратите внимание: аннотации опубликованы
Страница 151 и 152:
Обратите внимание: аннотации опубликованы
странице 153 и 154:
Обратите внимание: аннотации опубликованы
странице 155 и 156:
Обратите внимание: аннотации публикуются
стр. 157 и 158:
Обратите внимание: аннотации публикуются
стр. 159 и 160:
Обратите внимание: аннотации publishe
Page 161 и 162:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 163 и 164:
Обратите внимание: аннотации публикуются
Page 165 и 166:
A.Talip, B., 144 Abaitua, F., 79, 1
Page 167 и 168:
Filed Under: Filed Under:Разное

Ошибки при работе на портале ФНС nalog.ru — Удостоверяющий центр СКБ Контур

При регистрации Юридического лица появляется ошибка «У Вас отсутствуют полномочия действовать от лица организации без доверенности».

Контакты nalog.ru

Личный кабинет юридического лица ИФНС

Регистрация и авторизация

Диагностика подключения по сертификату электронной подписи

Диагностика подключения по сертификату ЕГАИС на аппаратном ключе

Возможности личного кабинета на 2020 год

Техподдержка: Инструкция по использованию электронной подписи на сайте Федеральной налоговой службы

Научно-исследовательский семинар «Электронные сервисы ФНС России в помощь налогоплательщикам»

Проверка юридического адреса налоговой инспекцией

Проверка юридического адреса при регистрации ООО

Проверка достоверности адреса юридического лица

Проверка юридического адреса налоговой инспекцией

Образцы доверенностей для ИФНС | Пример доверенностей для налоговой — Контур.Экстерн

Сфингозин-1-фосфатлиаза усиливает активацию IKKε для стимулирования IFN-опосредованного врожденного иммунного ответа на инфекцию вирусом гриппа A

Abstract

Введение

Материалы и методы

Клеточные линии и трансфекция

векторных конструкций ДНК

Вирусы

CRISPR-Cas9, нокаут SPL

Вестерн-блоттинг и Abs

ПЦР в реальном времени

Анализ репортерной люциферазы

Анализ коиммунопреципитации

Конфокальная микроскопия

РНК-интерференция

Статистический анализ

Результаты

SPL ингибирует репликацию IAV, которая связана с повышенным ответом IFN типа I.

Эндогенный SPL важен для эффективной индукции ответов IFN при клеточной чувствительности к вРНК гриппа

SPL взаимодействует с IKKε и усиливает активацию IKKε, что приводит к усилению продукции IFN типа I

IKKε важен для противовирусного эффекта, проявляемого SPL при инфекции IAV.

SPL усиливает ответы IFN типа I независимо от его ферментативной активности

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Footnotes

К сожалению, запрашиваемая страница не найдена.

МФС России No.35 в Москве

Адрес ФНС №35 по г. Москве

Индекс ИФНС 7735 в Москве:

Физический адрес ИФНС 7735 в Москве:

Ближайшие станции метро к налоговой инспекции 7735 в Москве:

Как добраться до ИФНС 7735 в Москве:

Телефоны IFNS 7735 в Москве:

Реквизиты ФНС 35 по г. Москве

Официальное наименование налоговой инспекции:

Налоговый кодекс:

ИНН / КПП налоговая инспекция:

Платежные реквизиты налоговой инспекции:

Структура ИФНС 35 в Москве

Начальники налоговой инспекции 7735 по Москве:

Отделения ИФНС 7735 в Москве:

Время работы ИФС 35 в Москве

Часы проверки:

Время работы операционной:

Обслуживаемые адреса по ИФНС 35 в Москве

Коды ОКТМО участков, принадлежащих ФНС 35 по г. Москве:

Официальный сайт ФНС 35 по Москве

Весенняя конференция 2011 — Общество общей микробиологии

You May Also Like

Ооо отчуждение доли – 21. /

Список торговых площадок россии – АЭТП — Список площадок

Заработок на картах – 4 способа + полезные советы

Добавить комментарий Отменить ответ