Ифнс задолженность: Узнать задолженность по налогам физического лица по ИНН через интернет

Мы продуцировали рекомбинантный белок IFNλ4 в E. coli и не наблюдали каких-либо существенных различий в поведении IFNλ4 по сравнению с другими изоформами. IFNλ при очистке. Во-первых, мы протестировали активность IFNλ4 в стандартном анализе репортерного гена, используя ген люциферазы под контролем промотора гена IFI6 (Uze and Monneron, 2007).Полученные кривые доза-ответ были сопоставимы с IFNλ3 и IFNλ4. Кроме того, мы протестировали индукцию индивидуальных ISG как IFNλ3, так и IFNλ4, и снова мы наблюдали сопоставимые уровни индукции обеими изоформами. Таким образом, мы заключаем, что IFNλ3 и IFNλ4 одинаково сильны в индукции ISG.

Основываясь на низком сходстве последовательностей между IFNλ4 и другими изоформами IFNλ в области, которая, как известно, связывает IL-10R2, Прокунина-Олссон и др. (2013) по понятным причинам поставили под вопрос, использует ли IFNλ4 эту рецепторную цепь для передачи сигналов.Во-первых, мы подтвердили использование рецепторной цепи IFNλR1 посредством IFNλ4, поскольку передача сигналов IFNλ4 была восстановлена ​​в клетках HEK293 после трансфекции IFNλR1 . Затем мы продемонстрировали участие IL-10R2 как путем нокдауна siRNA, так и путем блокирования цепи IL-10R2 специфическим антителом, которое было использовано для определения рецепторного использования других IFNλ (Sheppard et al, 2003). Таким образом, IFNλ4 приводит к активации интерферонового ответа и опосредует противовирусные эффекты через канонический рецепторный комплекс IFNλ, состоящий из IFNλR1 и IL-10R2.Однако эти результаты не исключают возможности того, что IFNλ4 может передавать сигналы через другие типы цитокиновых рецепторов, но они указывают на то, что, если бы такая передача сигналов существовала, она не включала бы регуляцию классических ISG.

IFNλ4 является недостатком в контексте инфекции HCV, несмотря на то, что он обладает сильной анти-HCV активностью.

Мы измерили противовирусную активность IFNλ4 против HCV, HCoV-229E и MERS-CoV и сравнили ее с противовирусной активностью IFNλ3 и IFNα2. . К нашему удивлению, противовирусная активность IFNλ3 и IFNλ4, соответственно, была неотличима на всех протестированных моделях вирусной инфекции.В отношении ВГС мы протестировали две разные линии печеночных клеток, Huh7 и HepG2, и ни в одном случае мы не наблюдали никакой разницы между IFNλ3 и IFNλ4. Аналогичным образом, используя первичные клетки HAE для инфицирования HCoV-229E или MERS-CoV, мы не наблюдали никакой разницы между IFNλ3 и IFNλ4. Это примечательно, поскольку идентичность последовательностей между двумя изоформами составляет всего 29% (Prokunina-Olsson et al, 2013), а наши предварительные биоинформатические исследования показывают, что последовательность белка IFNλ4 хорошо сохраняется среди млекопитающих (данные не показаны).Таким образом, должно было существовать эволюционное давление, чтобы сохранить IFNλ4 в качестве функционального белка на протяжении всей эволюции млекопитающих до внезапного появления мутации сдвига рамки считывания у людей. Поскольку инактивация гена IFNL4 сильно коррелирует с повышенной вероятностью спонтанного клиренса HCV, а также с положительным ответом на лечение IFN типа I, похоже, что выработка белка IFNλ4 на самом деле является недостатком во время инфекции HCV. . Более того, у людей, по-видимому, существует положительный отбор по мутации сдвига рамки считывания, отменяющей продукцию IFNλ4 (Prokunina-Olsson et al, 2013).В настоящее время неизвестно, обусловлен ли этот выбор исключительно ВГС. Продукция IFNλ4 может быть полезной даже в контексте других вирусных инфекций. Таким образом, недавно было сообщено, что SNP, которые оказались благоприятными для результата лечения, а также вероятность спонтанного исчезновения HCV, связаны с плохим выздоровлением от инфекции вируса гепатита B (Kim et al, 2013).

Как функциональный интерферон внезапно становится помехой во время инфекции ВГС — это парадокс, который мы в настоящее время не можем объяснить.Как обсуждалось выше, индукция ISGs происходит через канонический рецепторный комплекс IFNλ, но мы не можем исключить, что IFNλ4 имеет активность вне индукции ISGs, которая может опосредоваться через еще не идентифицированный рецептор. Однако наши данные показывают, что IFNλ4 очень активен против HCV, несмотря на то, что было показано, что он является предиктором плохой реакции на HCV. Текущие данные не могут исключить косвенные генетические эффекты, и, таким образом, не доказано, что белок IFNλ4 является причинным фактором плохого прогноза для пациентов с ВГС с функциональным геном IFNL4 .Кроме того, на сегодняшний день не существует доказательств присутствия белка IFNλ4 у пациентов с ВГС. Однако, если предположить, что белок IFNλ4 является причинным агентом, это может свидетельствовать о сложной взаимосвязи между IFNλ4 и HCV у людей, где IFNλ4 каким-то образом нарушает полный иммунный ответ на HCV. Мы получили полностью функциональный белок IFNλ4, который следует использовать для дальнейших исследований IFNλ4 на клетках печени и иммунной системы. Кроме того, будет важно выяснить, влияет ли HCV на селекцию аллеля TT (нефункционального IFNλ4) у людей и влияет ли введение аллеля TT на восприимчивость к другим вирусным инфекциям.

Плохая секреция IFNλ4 не определяется SP

Ранее сообщалось о неспособности белка IFNλ4 правильно секретироваться клетками, и авторы предположили, что это может быть связано со слабым SP (Prokunina-Olsson et al, 2013). Мы получили химерные кДНК, в которых мы заменили SP между IFNλ3 и IFNλ4. Здесь мы наблюдали, что IFNλ4 удерживался в клетках независимо от того, какой SP использовался, и аналогичным образом секреция зрелого белка IFNλ3 не подвергалась значительному влиянию используемого SP.С помощью как иммунопреципитации, так и осаждения ацетоном мы смогли показать, что IFNλ4 секретируется, но с гораздо меньшей эффективностью, чем то, что наблюдается для IFNλ3, что также отражается сниженной активностью среды из клеток, трансфицированных IFNλ4, по сравнению со средой из клеток, трансфицированных IFNλ3. клетки.

Гликозилирование IFNλ4 необходимо для правильной секреции и не влияет на активность

Мы проверили наличие внутриклеточного IFNλ4 с помощью вестерн-блоттинга клеточных лизатов и наблюдали две изоформы IFNλ4.Расщепление с помощью PNGase F, которое удаляет N-связанные гликаны, показало, что это произошло из-за неполного гликозилирования IFNλ4. Используя осаждение ацетоном для концентрирования белка в среде, мы смогли показать, что весь секретируемый белок IFNλ4, по-видимому, содержит N-связанное гликозилирование. Это согласуется с нынешней догмой о том, что белкам необходимо завершить гликозилирование перед экспортом во внеклеточную среду. Нам не ясно, как клетка ощущает разницу между белками, которые гликозилированы, как IFNλ4, и белками, которые не гликозилированы, как IFNλ3.Мы получили мутант IFNλ4 с дефицитом гликозилирования (IFNλ4 N61D) и наблюдали, что секреция этого мутанта сильно нарушена, подтверждая, что N-связанное гликозилирование необходимо для правильной секреции. Эти результаты также свидетельствуют о том, что IFNλ3 и IFNλ4 используют разные пути секреции и что удаления сайта N-связанного гликозилирования недостаточно, чтобы заставить IFNλ4 перейти на путь секреции, используемый негликозилированным IFNλ3.

Был также поднят вопрос, ухудшает ли гликозилирование активность.Поскольку белок E. coli является полностью активным, очевидно, что гликозилирование не требуется для активности, но может ли оно мешать связыванию рецептора? Наше моделирование структуры показало, что сахара были прикреплены за пределами сайта связывания рецептора, а активность, которую мы извлекли из супернатанта клеток, трансфицированных IFNλ4, которые, по-видимому, содержали только гликозилированный IFNλ4, предполагала, что сахара не мешали активности. Однако, чтобы подтвердить этот результат, мы использовали шарики Con A для удаления в среде гликозилированного IFNλ4.Поскольку это привело к почти полной потере активности, мы пришли к выводу, что IFNλ4, секретируемый клетками HEK293, является гликозилированным и активным.

Плохой процессинг и секреция белка IFNλ4 в настоящее время выделяют его по сравнению с другими белками IFNλ, и наши данные предполагают, что блокирование секреции происходит после транслокации в Гольджи, поскольку SP, по-видимому, качественно откололся. Отсутствие секреции IFNλ4 привело к тому, что в нескольких новостях и обзорах было высказано предположение о наличии внутриклеточного рецептора.Наши данные ясно демонстрируют, что IFNλ4 действительно использует нормальный рецептор, расположенный на клеточной мембране, хотя мы не можем формально исключить присутствие внутриклеточного рецептора. Однако мы считаем вероятным, что активация интерферонового пути, которая наблюдалась после трансфекции клеток HepG2 плазмидами, экспрессирующими IFNλ4 (Prokunina-Olsson et al, 2013), связана с низким уровнем секретируемого IFNλ4.

Материалы и методы

Экспрессия, очистка и рефолдинг белка

IFNλ4 ({«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «NM_001276254», «term_id»: «482513659», » term_text «:» NM_001276254 «}} NM_001276254, аминокислоты 23–179), перед которым стоит метка 6 × His, за которой следует сайт расщепления протеазой TEV, был оптимизирован для кодонов E.coli и приобретены у Invitrogen. Эту конструкцию клонировали в вектор pET-15b с использованием Fastdigest KpnI (Thermo Scientific, каталожный номер FD0524) и Fastdigest XhoI (Thermo Scientific, каталожный номер FD0694). BL21 (DE3) Клетки E. coli , трансформированные плазмидами, выращивали при 37 ° C в среде Лурия Бертани, содержащей 100 мкг / мл ампициллина и 100 мкл концентрата пеногасителя A (Sigma-Aldrich, каталожный номер A5633), при непрерывном встряхивании до OD ₆₀₀ из 0.8–1. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида и инкубировали еще 4 часа при 37 ° C. Рефолдинг и очистку выполняли, как описано ранее (Dellgren et al, 2009).

Плазмиды

Векторы pEF2-IFNλ3 и pEF2-IFNλR1 были любезно подарены профессором Сергеем Котенко (Медицинская школа UMDNJ, Нью-Джерси, Ньюарк, США). Ген IFNL4 человека ({«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «NM_001276254», «term_id»: «482513659», «term_text»: «NM_001276254»}} NM_001276254) , включая SPSP, были приобретены у Invitrogen.Следующие конструкции были созданы с использованием Accupol (Amplicon, каталожный номер 210302) в соответствии с инструкциями производителя: IFNλ4_FLAG (шаблон: IFNλ4, прямой праймер: gcttggtaccatgcggccgagtgtctgg, обратный праймер: agttctagatcacttgtcatcgtcatccttgtaatcacttgtcatcgtcatccttgtaatcactgatgatgtccttgtaatgcagtgtccttgtgcc3 праймер: agttctagatcacttgtcatcgtcatccttgtaatcacttccgacacacaggtccccactggc), IFNλ3SP_IFNλ4_FLAG (Шаблон: IFNλ4, прямой праймер: gcttggtaccatgaccggggactgcatgccagtgctggtgctgatggccgcagtgctgaccgtgactggagcagccccccggcgctgcctgctctcgc, обратный праймер: agttctagatcacttgtcatcgtcatccttgtaatccgatccgaggcaaggccc) и IFNλ4SP_IFNλ3_FLAG (Шаблон: pEF2-IFNλ3, прямой праймер: gcttggtaccatgcggccgagtgtctgggccgcagtggccgcggggctgtgggtcctgtgcacggtgatcgcagaggttcctgtcgccaggctccgcgggg, обратный праймер: agttctagatcacttgtcatcgtcatccttgtaatcacttccgacacacaggtccccactggc), а также IFNλ4_MYC (Шаблон: IFNλ4 , прямой праймер: gcttggtaccatgcggccgagtgtctgg, re стих праймер: agttctagatcacagatcctcctcactaatcagtttctgctccgatccgaggcaaggccc), IFNλ3_MYC (Шаблон pEF2-IFNλ3, прямой праймер: gcttggtaccatgaccggggactgc, обратный праймер: agttctagatcacagatcctcctcactaatcagtttctgctcacttccgacacacaggtccccactggc), IFNλ3SP_IFNλ4_MYC (Шаблон: IFNλ4, прямой праймер: gcttggtaccatgaccggggactgcatgccagtgctggtgctgatggccgcagtgctgaccgtgactggagcagccccccggcgctgcctgctctcgc, обратный праймер: agttctagatcacagatcctcctcactaatcagtttctgctccgatccgaggcaaggccc) и IFNλ4SP_IFNλ3_MYC (Шаблон: pEF2-IFNλ3, прямой праймер: gcttggtaccatgcggccgagtgtctgggccgcagtggccgcggggctgtgggtcctgtgtgcacggtgatcgcagaggttcctgtcgccaggctccgcgggg, обратный праймер: agttctagatcactacagatcctcctcactcactgaccactcactcactacagatcctcctcactcactgactgaccactcacagatcctcctcactgactgaccctacИспользовалась следующая программа ПЦР 1:95 ° C в течение 5 минут 2:30 циклов 95 ° C в течение 1 минуты, 59 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 1 минуты и 45 секунд 3: 72 ° C в течение 7 минут . Все конструкции были клонированы в вектор pEF2 с использованием Fastdigest Kpn I (Thermo Scientific, каталожный номер FD0524) и Fastdigest XbaI (Thermo Scientific, каталожный номер FD0684) в соответствии с инструкциями производителя.

IFNλ4-мутантный IFNλ4 N61D был получен посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием IFNλ4_FLAG в векторе pEF2 в качестве матрицы.Реакцию проводили с использованием PfuUltra II с праймерами (gctgggggcagcgcgactgctccttccgcccc и ggggcggaaggagcagtcgcgctgcccccagc) в соответствии с инструкциями производителя. Использовалась следующая программа ПЦР 1:95 ° C в течение 5 минут 2:30 циклов 95 ° C в течение 1 минуты, 59 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 5 минут и 45 секунд 3: 72 ° C в течение 7 минут .

Культура клеток

Если не указано иное, все клетки выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.Кроме того, в клетки Huh-lunet добавляли 2 мМ L-глутамина и выдерживали при отборе бластицидина (5 мкг / мл). Клеточная линия HL-116 была дополнена гипоксантином, тимидином и аминоптерином и 400 мкг / мл G418. Клетки поддерживали при 37 ° C с 5% CO ₂ . Клетки HAE были созданы, как описано ранее (Kindler et al, 2013), и поддерживались в течение 2 месяцев.

Анализ активности на клетках HL-116

Активность IFNλ4 и IFNλ3 тестировали на клетках HL-116, клеточной линии, полученной из HT1080, содержащей репортерный ген люциферазы, контролируемый интерферон-индуцируемым промотором IFI6.Кроме того, клетки HL-116 стабильно трансфицировали IFN λ R1 , чтобы сделать их чувствительными к IFNλ (Uze and Monneron, 2007). Для измерения активности интерферона 1 × 10 ⁴ клеток HL-116 помещали в 96-луночный планшет и обрабатывали в трех повторностях в течение 3 часов 8 разведениями IFNλ3 или IFNλ4 в диапазоне концентраций, охватывающем 0,0001–1000, нг / мл. . Клетки лизировали и активность люциферазы количественно оценивали с использованием системы анализа люциферазы DualGlo (Promega).

Количественная ПЦР в реальном времени.

Клетки HepG2 высевали с плотностью 2 × 10 ⁵ клеток на лунку в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов.Затем добавляли свежую среду с указанными интерферонами. Клетки инкубировали в течение 4 ч, а затем лизировали, и РНК очищали с использованием набора для экстракции (Omega) в соответствии с инструкциями производителя. Синтез кДНК и анализ с помощью количественной ПЦР в реальном времени выполняли, как описано ранее (Melchjorsen et al, 2009). В этой ссылке также перечислены последовательности праймеров. Точки пересечения кривых амплификации определяли с использованием второго метода производных в программе Roche LightCycler 3.5 (Рош). Данные, полученные с помощью Light Cycler, были нормализованы с использованием математической модели, описанной Pfaffl (2001). Эксперименты проводили в четырех повторностях. Для необработанного контроля среднее значение четырех повторов использовали для расчета индукции кратности для других образцов.

siRNA и трансфекция

Для экспериментов по трансфекции 1 × 10 ⁵ клеток HEK293 на лунку высевали в 24-луночный планшет в DMEM с добавлением 10% FBS и оставляли в покое на 24 часа.Через 24 часа клетки трансфицировали миРНК против IL-10R2 или контрольной миРНК (ON-TARGETplus Pool, Thermo Scientific) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 18 часов после трансфекции среду заменяли свежей средой с добавлением 10% FBS; и через 24 часа после трансфекции клетки трансфицировали плазмидой pEF2, кодирующей IFN λ R1 , люциферазу Firefly под контролем промотора Mx1 (Jorns et al, 2006), люциферазу Renilla под контролем β -актин промотор и миРНК против IL-10R2 или контрольная миРНК.Через 6 часов среду заменяли свежей средой с добавлением 10% FBS, и клетки оставляли в покое на следующие 12 часов. Через 18 часов после трансфекции клетки индуцировали 10 нг / мл IFNλ3, IFNλ4 или 1000 ед / мл IFNα2 (Chemicon) в течение 24 часов. Через 24 часа клетки промывали PBS и лизировали буфером для пассивного лизиса (Promega). Лизаты вращали при 10000 r.c.f. в течение 2 мин при 4 ° C, и очищенные лизаты использовали для измерения активности люциферазы (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega).

Анализ нейтрализации

Клетки HEK293 высевали в 48-луночные планшеты в концентрации 4 × 10 ⁵ клеток на мл в DMEM с добавлением 10% FBS. Через 24 часа клетки трансфицировали с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen) плазмидами, кодирующими IFN λ R1 , люциферазу Firefly под контролем промотора Mx1 и люциферазу Renilla под контролем β -актина. промотор. Через двадцать часов после трансфекции клетки инкубировали в течение 1 часа в среде, содержащей IL-10R2 (R&D Systems) или контрольное антитело в концентрации 6 мкг / мл, после чего клетки индуцировали 10 нг / мл IFNλ3 или IFNλ4 или 1000 ед. / мл IFNα2a.После 24 ч индукции клетки лизировали пассивным буфером для лизиса (Promega), и очищенные лизаты использовали для измерения активности люциферазы (система анализа репортеров двойной люциферазы, Promega).

SDS-page гель-электрофорез и вестерн-блоттинг

Белки обрабатывали на 12% SDS-PAGE гелях. Окрашивание геля производили с помощью кумасси бриллиантового синего. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием переносящей мембраны PVDF STAR 0,45 мкм (Applichem) с использованием субстрата увеличенного времени действия SuperSignal West Dura (Thermo Scientific).Мембрана экспонировалась на медицинской пленке MG-SR plus (Konica Minolta), которая была проявлена ​​на пленочном процессоре AGFA CURIX 60. Используемые антитела представляли собой мышиное антитело MYC (гибридома мыши Mycl-9E10), мышиное моноклональное антитело против FLAG® M2 (Sigma-Aldrich, каталожный номер F3165), козье антитело к IL-10R2 (R&D Systems, каталожный номер AF874) и кроличье поликлональное антитело. Антитело GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, каталожный номер FL-335). Антимышиные IgG, связанные с пероксидазой хрена видоспецифические цельные антитела овцы (GE Healthcare, каталожный номер NA931) и поликлональные свиньи антикроличьи иммуноглобулины / HRP (Dako Cytomation, каталожный номер P 0399).

Инфекция HAE HCoV-229E

Клетки бронхиального эпителия человека были выделены у пациентов (> 18 лет), которые прошли бронхоскопию и / или хирургическую резекцию легкого в ходе диагностики любого легочного заболевания и дали информированное согласие. Это было сделано в соответствии с местным законодательством штата Кантон Санкт-Галлен, Швейцария, в рамках биобанка биопсии легких Санкт-Галлена (SGLBB) Кантональной больницы Санкт-Галлена, получившего одобрение этического комитета Кантона. Санкт-ПетербургГаллен (EKSG 11/044, EKSG 11/103). Культуры HAE получали, как описано ранее (Dijkman et al, 2009). Культуры HAE использовали через 28 дней после воздействия воздуха на апикальную поверхность для исследований инфекции. IFNαA / D (I4401, Sigma Aldrich), IFNλ3 или IFNλ4 добавляли в базолатеральную среду за 4–16 ч до инфицирования, после чего базолатеральную среду заменяли и апикально наносили 20 000 БОЕ HCoV-229E-ren. Через 24 часа после инфицирования определяли активность люциферазы Renilla в клеточных лизатах, инфицированных HCoV-229E-ren.

Заражение БВРС-КоВ проводили, как описано ранее (Kindler et al, 2013).

Репликация ВГС

Клеточная линия Huh7-Lunet N hCD81-FLuc была получена из родительской клеточной линии Huh7-Lunet N hCD81 (Bitzegeio et al, 2010) путем переноса лентивирусного гена, как описано ранее (Gentzsch et al, 2011). Он конститутивно экспрессирует ген люциферазы Firefly (FLuc), который используется в нашем анализе в качестве маркера жизнеспособности клеток.

Всего 4 × 10 ⁶ клеток Huh7-Lunet N hCD81-FLuc или 6 × 10 ⁶ клеток HepG2-CD81 / mi122 (Narbus et al, 2011) были подвергнуты электропорации с 5 мкг in vitro — транскрибировал РНК JcR-2a, как описано ранее (Haid et al, 2010).Конструкция JcR-2a соответствует полноразмерному инфекционному химерному клону Jc1 HCV (Pietschmann et al, 2006), экспрессирующему репортерный ген люциферазы Renilla (Reiss et al, 2011). Электропорированные клетки ресуспендировали в 20 мл полной среды и высевали в 96-луночные чашки (100 мкл / лунку). Через четыре часа после электропорации клеточную среду заменяли серийно разведенным IFN α2b (IntronA®, Essex Pharma), IFNλ3 или IFNλ4. Для каждого разведения использовали три лунки. Клетки лизировали через 48 (производное HepG2) или 72 часа (Huh7-lunet) после электропорации в буфере для пассивного лизиса (Promega) и измеряли активность люциферазы Renilla для оценки репликации HCV (Vieyres and Pietschmann, 2013).

Активность секретируемого IFN

Для экспериментов по трансфекции клетки HEK293 высевали в 24-луночные планшеты (1,5 × 10 ⁵ клеток / лунку) или 6-луночные планшеты (7 × 10 ⁵ клеток / лунку) в DMEM с добавлением 10% FBS и оставляли в покое на 24 часа. Через 24 часа клетки трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) либо плазмидами, кодирующими IFNλ (6-луночный формат), либо котрансфицировали плазмидами, кодирующими IFN λ R1 , люциферазу Firefly под контролем промотора Mx1 . и Renilla Люцифераза под контролем промотора β -актина (24-луночный формат).Через шесть часов после трансфекции клеткам, трансфицированным IFN-λ, давали свежую среду (DMEM, 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Через двадцать часов после трансфекции собирали среду из клеток, трансфицированных IFN-λ, центрифугировали при 500 об / мин. в течение 8 мин и добавляли к клеткам, котрансфицированным IFNλR1, и люциферазами в различных разведениях. Через 24 ч клетки промывали PBS и лизировали. Лизаты центрифугировали при 10000 r.c.f. в течение 2 мин при 4 ° C, и очищенные лизаты использовали для измерения активности Firefly (система анализа репортеров с двойной люциферазой, Promega).

Трансфекция клеток HEK293 с использованием полиэтиленимина

Всего 8 × 10 ⁶ клеток HEK293 высевали в 15-сантиметровую чашку и трансфицировали IFNλ3-FLAG, IFNλ4-FLAG или пустым вектором (pcDNA3.1). Через 5–6 ч среду меняли на среду без сыворотки, и клетки трансфицировали с использованием 40 мкг ДНК на чашку с использованием полиэтиленимина (PEI). Всего 40 мкг ДНК смешивали со средой без антибиотиков и сывороткой до концентрации 1,5 мл.

Всего 120 мкл PEI смешивали со средой без антибиотиков и сывороткой до концентрации 1.5 мл. ДНК и PEI смешивали и оставляли на 15–20 мин при комнатной температуре перед добавлением в клетки. Клетки инкубировали в течение 18 ч, после чего среду выделяли центрифугированием при 7000 об / мин. на 10 мин.

Иммунопреципитация

Всего 8 × 10 ⁶ клеток HEK293 выращивали в 15-сантиметровых чашках с использованием 20 мл среды и трансфицировали, как описано. Супернатанты инкубировали со 100 мкл аффинного геля ANTI-FLAG® M2 (SIGMA-Aldrich, каталожный номер A2220) в течение 3 часов. Гранулы центрифугировали при 8000 об.вечера. за 1 мин. Супернатант удаляли, и шарики дважды промывали 0,5 мл PBS, содержащего 2% Triton X-100. Затем шарики инкубировали в буфере для элюции (PBS, содержащий 2% Triton X-100 и 500 мкг пептида FLAG (SIGMA-Aldrich, каталожный номер F3290) в течение 30 минут. Гранулы осаждали центрифугированием при 8000 об / мин в течение 1 минуты. и супернатант выделяли и анализировали вестерн-блоттингом.

Дегликозилирование

Дегликозилирование проводили с использованием Glycerol Free PNGase F (New England Biolabs, номер по каталогу P0705S).Для дегликозилирования 9 мкл клеточного лизата смешивали с 1 мкл 10-кратного денатурирующего буфера гликопротеина и денатурировали нагреванием при 100 ° C в течение 10 мин. Затем добавляли 5 мкл H ₂ O, 2 мкл реакционного буфера G7, 2 мкл 10% NP-40 и 1 мкл PNGase F. Эту смесь инкубировали при 37 ° C в течение 15 ч и анализировали вестерн-блоттингом.

Осаждение ацетоном

Среду смешивали в соотношении среды к холодному (-20 ° C) ацетону 1: 4. Образцы встряхивали и инкубировали при -20 ° C в течение 60 мин.Белок осаждали центрифугированием при 6000 об / мин. на 45 мин. Супернатант декантировали и осадок белка ресуспендировали в PBS.

Конканавалин A

Всего 2 мл свободной от глюкозы среды DMEM (Sigma) из IFNλ4-FLAG и ложных (pcDNA3.1) трансфицированных клеток инкубировали в течение 30 минут со 100 мкл шариков конканавалина A (Con A). Гранулы и среду добавляли в колонку и собирали поток через нее. Гранулы промывали PBS перед инкубацией с 1 мл буфера для элюирования (DMEM без глюкозы с добавлением 500 мМ глюкозы) в течение 30 мин.Активность потока и элюата исследовали на клетках HEK293, котрансфицированных плазмидами, кодирующими IFN λ R1 , Firefly люциферазу под контролем промотора Mx1 и Renilla люциферазы под контролем Промотор β -актина (24-луночный формат), как описано ранее. Содержание белка оценивали в потоке, элюате и на шариках методом вестерн-блоттинга. Гранулы кипятили в загрузочном буфере SDS в течение 10 мин перед нанесением на гель.

Saphnelo (анифролюмаб) одобрен в США для лечения средней и тяжелой системной красной волчанки

AstraZeneca’s Saphnelo (анифролюмаб-фния) был одобрен в США для лечения взрослых пациентов с умеренной и тяжелой системной красной волчанкой (СКВ), получающих стандартную терапию. ¹

Одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) было основано на данных об эффективности и безопасности, полученных в рамках программы клинических разработок Saphnelo , включая два испытания TULIP Phase III и MUSE Phase II.В этих испытаниях у большего числа пациентов, получавших Saphnelo , наблюдалось снижение общей активности заболевания во всех системах органов, включая кожу и суставы, и достигалось стойкое снижение использования пероральных кортикостероидов (OCS) по сравнению с плацебо, причем обе группы получали стандартную терапию. ^1,2,3,4

Это первое одобрение регулирующих органов для антагониста рецепторов интерферона I типа (IFN типа I) и единственное новое лечение, одобренное для лечения СКВ более чем за 10 лет. ^5,6 IFN типа I играет центральную роль в патофизиологии волчанки, а усиление передачи сигналов IFN типа I связано с повышенной активностью и тяжестью заболевания. ^7,8,9,10,11

Доктор Ричард Фьюри, руководитель отделения ревматологии в Northwell Health, Нью-Йорк, США и главный исследователь программы клинических разработок Saphnelo , сказал: «Наши цели лечения системной красной волчанки — снизить активность заболевания, предотвратить повреждение органов либо самой болезнью, либо лекарствами, особенно стероидами, и улучшение качества жизни. Сегодняшнее одобрение анифролюмаба представляет собой большой шаг вперед для всего сообщества волчанки.Теперь врачи смогут предложить новое эффективное лечение, которое привело к значительному улучшению общей активности заболевания при одновременном сокращении использования кортикостероидов ».

Мене Пангалос, исполнительный вице-президент BioPharmaceuticals R&D, сказал: «Сегодняшнее знаменательное утверждение Saphnelo является кульминацией многолетних новаторских исследований AstraZeneca пути интерферона типа I, центрального фактора в патофизиологии системной красной волчанки. Это новаторское лекарство может значительно улучшить жизнь пациентов, страдающих этим часто изнурительным заболеванием.”

Побочные реакции, которые чаще возникали у пациентов, получавших Saphnelo в трех клинических испытаниях, включали назофарингит, инфекцию верхних дыхательных путей, бронхит, реакции, связанные с инфузией, опоясывающий лишай и кашель. ¹

СКВ, наиболее распространенная форма волчанки, поражающая до 300 000 человек в США, непропорционально поражает афроамериканцев, латиноамериканцев и азиатское население. ¹² Это сложное аутоиммунное заболевание, которое может поражать любой орган, и люди часто испытывают изнуряющие симптомы, длительное повреждение органов и плохое качество жизни, связанное со здоровьем. ^12,13,14,15

Результаты исследования TULIP-2 Phase III были опубликованы в The New England Journal of Medicine в январе 2020 года, результаты исследования TULIP-1 Phase III были опубликованы в The Lancet Rheumatology в декабре 2019 года и результаты MUSE Исследование фазы II было опубликовано в журнале Arthritis & Rheumatology в ноябре 2016 года.

Saphnelo находится на рассмотрении регулирующих органов ЕС и Японии на предмет СКВ. Начато исследование фазы III при СКВ с использованием подкожного введения, и запланированы дополнительные испытания фазы III для лечения волчаночного нефрита, кожной красной волчанки и миозита.

Финансовые соображения
AstraZeneca приобрела глобальные права на Saphnelo по эксклюзивной лицензии и соглашению о сотрудничестве с Medarex, Inc. в 2004 году. Возможность совместного продвижения продукта для Medarex истекла после ее приобретения компанией Bristol-Myers Squibb (BMS ) в 2009 году. В соответствии с соглашением AstraZeneca будет выплачивать BMS роялти от низкого до среднего подросткового возраста за продажи в зависимости от географического положения.

Системная красная волчанка
СКВ — это аутоиммунное заболевание, при котором иммунная система атакует здоровые ткани в организме. ¹⁶ Это хроническое и сложное заболевание с множеством клинических проявлений, которое может поражать многие органы и вызывать ряд симптомов, включая боль, сыпь, усталость, отек суставов и лихорадку. ¹³ Более чем у 50% пациентов с СКВ развивается необратимое повреждение органов, вызванное заболеванием или существующими методами лечения, которое усугубляет симптомы и увеличивает риск смерти. ^17,18 По крайней мере пять миллионов человек во всем мире страдают волчанкой. ¹⁹

TULIP-1, TULIP-2 и MUSE
Все три испытания Saphnelo (TULIP-1, TULIP-2 и MUSE) были рандомизированными двойными слепыми плацебо-контролируемыми испытаниями с участием пациентов с СКВ средней и тяжелой степени тяжести. получали стандартную терапию. ¹ Стандартная терапия включала, по крайней мере, одно из следующего: ОКН, противомалярийные препараты и иммунодепрессанты (метотрексат, азатиоприн или микофенолят мофетил). ^2,3,4

Основная программа TULIP (лечение неконтролируемой волчанки с помощью интерферонового пути) Фаза III включала два испытания, TULIP-1 и TULIP-2, в которых оценивалась эффективность и безопасность Saphnelo по сравнению с плацебо. ^2,3 TULIP-2 продемонстрировал превосходство по нескольким конечным точкам эффективности по сравнению с плацебо в обеих группах, получавших стандартную терапию.В ходе исследования 362 подходящих пациента были рандомизированы (1: 1) и получали фиксированную дозу внутривенного вливания 300 мг Saphnelo или плацебо каждые четыре недели. TULIP-2 оценил влияние Saphnelo на снижение активности заболевания по шкале BILAG-Based Composite Lupus Assessment (BICLA). ² В TULIP-1 457 подходящих пациентов были рандомизированы (1: 2: 2) и получили фиксированную дозу внутривенного вливания 150 мг Saphnelo , 300 мг Saphnelo или плацебо каждые четыре недели в дополнение к стандартному терапия.Исследование не достигло своей основной конечной точки, основанной на композитном показателе SLE Responder Index 4 (SRI4). ³

В исследовании MUSE Phase II оценивалась эффективность и безопасность двух доз Saphnelo по сравнению с плацебо. В MUSE 305 взрослых были рандомизированы и получали фиксированную дозу внутривенного вливания 300 мг Saphnelo , 1000 мг Saphnelo или плацебо каждые четыре недели в дополнение к стандартной терапии в течение 48 недель. Испытание показало улучшение по сравнению с плацебо по нескольким конечным точкам эффективности с обеими группами, получавшими стандартную терапию. ⁴

При СКВ, наряду с основной программой TULIP Phase III, Saphnelo продолжает оцениваться в долгосрочном расширенном исследовании фазы III и исследовании фазы III по оценке подкожных родов. ^20,21 Кроме того, AstraZeneca изучает потенциал Saphnelo при различных заболеваниях, при которых IFN типа I играет ключевую роль, включая волчаночный нефрит, кожную красную волчанку и миозит.

Saphnelo
Saphnelo (анифролюмаб) — полностью человеческое моноклональное антитело, которое связывается с субъединицей 1 рецептора IFN типа I, блокируя активность IFN типа I. ⁴ IFN типа I, такие как IFN-альфа, IFN-бета и IFN-каппа, являются цитокинами, участвующими в регуляции воспалительных путей, участвующих в СКВ. ^{7,9,10,11,22,23} У большинства взрослых с СКВ повышенная передача сигналов IFN типа I связана с повышенной активностью и тяжестью заболевания. ^7,8

AstraZeneca в области респираторной и иммунологии
Респираторная и иммунология, часть компании BioPharmaceuticals, является одним из основных направлений деятельности AstraZeneca в области борьбы с болезнями и является ключевым фактором роста компании.

AstraZeneca — признанный лидер в области респираторной помощи с 50-летним опытом. Компания стремится преобразовать лечение астмы и ХОБЛ, сосредоточив внимание на более раннем биологическом лечении, устранении предотвратимых приступов астмы и устранении ХОБЛ как одной из трех основных причин смерти. Первые респираторные исследования компании сосредоточены на новых научных исследованиях, касающихся иммунных механизмов, повреждения легких и аномальных процессов восстановления клеток при заболеваниях и дисфункции нейронов.

Располагая общими путями и факторами основных заболеваний в респираторной и иммунологии, AstraZeneca следует науке от хронических заболеваний легких до областей, связанных с заболеваниями, обусловленными иммунологией.Растущее присутствие компании в области иммунологии сосредоточено на пяти франшизах средней и поздней стадии с потенциалом лечения множественных заболеваний, в таких областях, как ревматология (включая системную красную волчанку), дерматологию, гастроэнтерологию и системные заболевания, вызванные эозинофилами. Амбиции компании AstraZeneca в области респираторной и иммунологии заключаются в том, чтобы добиться модификации болезни и прочной ремиссии для миллионов пациентов во всем мире.

AstraZeneca
AstraZeneca (LSE / STO / Nasdaq: AZN) — глобальная научная биофармацевтическая компания, которая занимается открытием, разработкой и коммерциализацией рецептурных лекарств в онкологии, редких заболеваниях и биофармацевтических препаратах, включая сердечно-сосудистые, почечные и другие. Метаболизм, респираторная и иммунология.Компания AstraZeneca, штаб-квартира которой находится в Кембридже, Великобритания, работает более чем в 100 странах, а ее инновационные лекарства используют миллионы пациентов по всему миру. Посетите сайт astrazeneca.com и подпишитесь на информацию о Компании в Twitter @AstraZeneca.

Взаимосвязи между подмножествами IL-17 +, Treg и pDC, которые различают инфицированные SIV элитные контроллеры, макаки-резус с низкой, средней и высокой вирусной нагрузкой

Abstract

Всесторонние исследования частот и абсолютных количеств различных клеточных линий, которые синтезируют IL-17 в крови и соответствующих тканях желудочно-кишечного тракта (GI), их корреляции с Treg CD4 ⁺ , Treg CD8 ⁺ , всего и IFN-α синтезирующие плазматические дендритные клетки (pDC) относительно вирусной нагрузки плазмы при инфекции SIV отсутствовали.Уникальная доступность инфицированных SIV макак-резус (RM), классифицируемых как элитные контроллеры (EC), а также макак с низкой, средней и высокой вирусной нагрузкой (HVL), предоставила уникальную возможность решить эту проблему. Результаты этих исследований показали, что ЭК продемонстрировали замечательную способность обращать вспять изменения, которые резко индуцируются SIV в различных клеточных линиях. Основные различия между EC и RM HVL в желудочно-кишечных тканях (GIT) заключались в поддержании и / или повышении уровней IL-17, синтезирующих CD4, CD8, и NK-клеток, и pDC, связанных с небольшим снижением уровней CD4. ⁺ Treg и IFN-α, синтезирующие pDC в EC, по сравнению со снижением уровней IL-17, синтезирующего CD4, CD8 и NK-клетки, связанное с увеличением pDC и IFN-α, синтезирующих pDC у обезьян HVL.Ранее недооцениваемая роль Treg CD8 ⁺ также была отмечена при умеренном увеличении EC, но при дальнейшем увеличении Treg CD8 ⁺ с увеличением VL у виремических обезьян. Также были отмечены положительные корреляции между ВН в плазме и снижением уровней Th27, Tc17, NK-17, CD4 ⁺ Treg и повышением уровней CD8 ⁺ Tregs, общих и пДК, синтезирующих IFN-α. Это исследование также выявило 2 дополнительных подмножества IL-17 ⁺ в ЖКТ как CD3 ^{— /} CD8 ⁺ / NKG2a ^— и CD3 ⁺ / CD8 ⁺ / NKG2a ⁺ подмножеств.Исследования также предполагают ограниченную роль пДК, синтезирующих IFN-α, в хронической иммунной активации, несмотря на стойкую повышающую регуляцию ISG. Наконец, повышенный стойкий врожденный иммунный ответ связан с плохим прогнозом. Эти результаты обеспечивают начальную основу для маркеров, которым необходимо следовать при разработке вакцины.

Образец цитирования: Khowawisetsut L, Pattanapanyasat K, Onlamoon N, Mayne AE, Little DM, Villinger F, et al. (2013) Взаимосвязь между подмножествами IL-17 ⁺ , Treg и pDC, которые различают инфицированные SIV элитные контроллеры, макак-резус с низкой, средней и высокой вирусной нагрузкой.PLoS ONE 8 (4): e61264. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264

Редактор: Кристиан Апетрей, Центр исследований вакцин Университета Питтсбурга, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 15 января 2013 г .; Дата принятия: 7 марта 2013 г .; Опубликовано: 19 апреля 2013 г.

Авторские права: © 2013 Khowawisetsut et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Г-жа Ладаван Ховависецут получила финансовую поддержку от Фонда исследований Таиланда (TRF) — доктора философии Королевского Золотого Юбилея. Программа (PHD / 0198/2550) и исследования, описанные выше, являются частичным выполнением ее докторской диссертации. Профессор Ковит Паттанапаньясат является лауреатом премии TRF, Senior Research Scholar Award. При поддержке гранта Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (RO1 AI078773 и OD 51POD1113 Национального института здоровья США) Национальному исследовательскому центру приматов Йеркса.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Старший автор Афтаб А. Ансари является членом редакционной коллегии PLOS ONE. Эта должность члена редакционной коллегии PLOS ONE не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Введение

Нарушение регуляции иммунного ответа после патогенной инфекции ВИЧ-1 у людей и инфекции SIV у нечеловеческих приматов (NHP) является одним из отличительных признаков и характеристик таких инфекций.Как возникает и сохраняется такое нарушение регуляции, было предметом изучения в течение последних двух десятилетий и продолжает оставаться предметом пристального интереса. Одна из новых причин такого интереса заключается в том, что, несмотря на высокоэффективную антиретровирусную терапию (АРТ), которая снижает вирусную нагрузку до почти неопределяемых уровней в течение длительных периодов времени, все же не способствует возвращению иммунных ответов и функций. «Здоровые» уровни, выраженные в сохранении хронической иммунной активации и постоянной повышенной восприимчивости к инфекционным агентам, ускорении заболеваемости болезнями органов-мишеней и новообразованиями [1] — [7].Таким образом, представляется разумным определить, как такие иммунные ответы становятся аномальными и какие стратегии можно успешно использовать для уменьшения и, возможно, обращения вспять таких явлений. Модель патогенной SIV-инфекции NHP представляет собой мощный инструмент, позволяющий начать разгадывать задействованные механизмы и определить кинетику, по которой развиваются такие аномалии, и попытаться определить более конкретные мишени для иммунных манипуляций.

Наша лаборатория в течение некоторого времени изучала модель SIV NHP, и данные по результатам этих исследований показывают, что различное количество молодых / взрослых самцов макак-резус индийского происхождения, инфицированных внутривенно либо SIVmac239, либо SIVmac251 после достижения заданного значения вирусной нагрузки в плазме, либо стать контроллерами ELITE (ЭК, <100 вирусных копий / мл) или поддерживать Низкую ВН (LVL, <10 000 вирусных копий / мл), Промежуточную ВН (ИВЛ, 10 000–100 000 вирусных копий / мл) или Высокую ВН (HVL,> 100 000 копий / мл) в отсутствие какой-либо противовирусной терапии (см. рисунок S1).Поскольку уставка VL наступает в течение 4-6 недель после заражения до полного созревания эффективного приобретенного вирусоспецифического иммунного ответа, разумно предположить, что события, которые происходят во время острой инфекции и в первую очередь опосредованы клетками врожденной иммунной системы, являются вероятно, будет играть главную роль в определении столь разнообразных клинических исходов [8] — [11].

Одной из стратегий определения механизмов, с помощью которых инициируется такая иммунная дисфункция, было изучение количественных и качественных изменений в клонах гемопоэтических клеток после инфицирования SIV.Эти исследования были основаны на выявлении изменений на основе ультраструктурных исследований, маркеров клеточной поверхности, уникальных для каждой клеточной линии, спектра синтезируемых цитокинов и внутриклеточных факторов транскрипции, экспрессируемых клетками, выделенными из периферической крови, тканей лимфатических узлов и тощей / колоректальной ЖКТ. ткани [12] — [21]. В отношении исследований, представленных в настоящем документе, эти исследования включали анализ изменений частот и абсолютных количеств IL-17, синтезирующих CD4 ⁺ Т-клеток (Th27), CD8 ⁺ Т-клеток (Tc17), NK-клеток (NK -17), регуляторные CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки (Treg), интерферон-альфа (IFN-α) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), синтезирующие плазматические дендритные клетки (pDC) [22] — [ 33], и это лишь некоторые из них.Как указано выше, эти предыдущие исследования были сосредоточены либо на отдельных, либо на комбинации некоторых из этих маркеров, а также на образцах от ограниченного числа животных и / или стадий заболевания. Этот факт побудил нас провести подробное исследование этих наборов маркеров на тканях неинфицированных и инфицированных вирусом SIV макак-резус с LVL, IVL, HVL и тех, которые классифицируются как EC. Было высказано предположение, что кросс-секционное исследование, разработанное для документирования взаимосвязей между субнаборами, синтезирующими ИЛ-17, регуляторными Т-клетками, которые потенциально влияют на функцию синтезирующих ИЛ-17 клеток, и пДК, в частности пДК, синтезирующие ИФН-α, обеспечит начальные понимание роли оси IL-17 / Treg / pDC в скорости прогрессирования заболевания.Поскольку недавние исследования выявили важную роль КПК, особенно во время острой инфекции, впоследствии было проведено проспективное исследование, сфокусированное на анализе IFN-α, его взаимосвязи с генами, стимулирующими интерферон (ISG), и TNF-α, синтезирующими КПК, на основе полученных результатов. на поперечном исследовании. Образцы крови и колоректальной биопсии от SIV-отрицательных и положительных сажистых мангабей также анализировались параллельно, поскольку этот вид является естественным хозяином SIV и обычно не вызывает каких-либо обнаруживаемых заболеваний.Таким образом, их параллельный анализ был направлен на предоставление данных, которые потенциально могли бы идентифицировать сходство по профилям устойчивости к болезням с профилями, полученными на инфицированных SIV макаках-резус, которые становятся ЭК и / или поддерживают LVL. Результаты этих исследований составляют основу настоящего отчета.

Материалы и методы

Источник образцов крови и колоректальной биопсии

Макаки-резус индийского происхождения (Macaca mulatta) и сажистые мангабеи (Cercocebus atys) содержались в Национальном исследовательском центре приматов Йеркса (YNPRC) Университета Эмори (Атланта, Джорджия) и содержались в соответствии с руководящими принципами Комитета по охране окружающей среды. Руководство по уходу и использованию лабораторных животных Института ресурсов лабораторных животных, Национального исследовательского совета и Министерства здравоохранения и социальных служб под названием «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных».Поперечное исследование было проведено на образцах от 18 неинфицированных макак-резус (RM), 12 SIV-отрицательных сажистых макак (SM), 18 естественно инфицированных SM, 55 молодых / взрослых самцов RM, которые были инфицированы внутривенно 1000 TCID50 SIVmac239 или SIVmac251 ( выращенные в день 3 Con-A активировали нормальные культуры PBMC-резус). RM, инфицированные SIV, были ретроспективно классифицированы как Elite Controllers (EC, n = 6), RM с LVL (n = 12), RM с IVL (n = 16) и RM с HVL (n = 21), как описано выше.Последующее проспективное исследование было выполнено на образцах ткани PBMC и колоректальной биопсии из групп макак-резус до и после внутривенной инфекции 1000 TCID50 SIVmac239, которые были частью другого исследования. Обезьяны были ретроспективно классифицированы как EC (n = 5), LVL (n = 6), IVL (n = 5) и HVL (n = 6), как указано выше. Вирусную нагрузку в плазме контролировали с помощью количественного определения бДНК на аликвотах плазмы с ЭДТА компанией Siemens Inc. (Беркли, Калифорния).

Заявление об этике

Все животные были рождены и содержатся в Национальном исследовательском центре приматов Йеркса Университета Эмори в соответствии с положениями Комитета по уходу и использованию ресурсов лабораторных животных.Животных кормили обезьяньей диетой (Purina) с добавлением свежих фруктов или овощей и воды ad libitum. Дополнительное обогащение обеспечивается и контролируется персоналом по обогащению Yerkes, а здоровье животных ежедневно контролируется персоналом по уходу за животными и ветеринарным персоналом, доступным круглосуточно. Обезьяны с признаками заболевания или дистресса, которые нельзя было облегчить с помощью стандартных анальгетиков и / или химиотерапии, были гуманно усыплены с использованием передозировки барбитуратов в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации.Описанные здесь исследования были выполнены в соответствии с протоколом IACUC № 2001186 «Врожденный иммунитет при инфекции SIV», который был рассмотрен и одобрен IACUC Университета Эмори. Ему присвоен номер протокола IACUC «YER-2001186-082414GA». Национальный исследовательский центр приматов Йеркса был полностью аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной организации по уходу за лабораторными животными с 1985 года. Все эксперименты были рассмотрены и одобрены учреждением Эмори по использованию и уходу за животными, а также комитетами по обзору биобезопасности.

Сбор образцов и выделение мононуклеарных клеток из крови и ректальной биопсии

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из гепаринизированной цельной крови с использованием стандартной процедуры центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque. Мононуклеарные клетки из ректальной биопсии выделяли, как описано ранее [26]. Вкратце, биопсии обрабатывали 500 ед. / Мл коллагеназы типа IV (Worthington, Lakewood, NJ) и 1 ед. / Мл ДНКазы (Promega, Madison, WI) в течение 2 часов.Затем полученную при биопсии суспензию клеток несколько раз пропускали через иглу 21G с последующим последовательным пропусканием через 100 мкМ, а затем через сетчатый фильтр для клеток 40 мкМ (BD Falcon ™), соответственно. Затем тканевую суспензию покрывали 30% / 60% градиентным раствором Перколла (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури). После центрифугирования при 2000 об / мин в течение 30 минут мононуклеарные клетки на границе раздела между 30% и 60% раствором Перколла собирали, промывали и повторно суспендировали в полной среде RPMI1640.Подсчет клеток и жизнеспособность клеток определяли с использованием метода красителя трипанового синего. Концентрации клеток доводили до 1 × 10 ⁶ клеток / мл в полной среде RPMI1640.

Моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромом

Различные конъюгированные с урохромом моноклональные антитела (mAb) были использованы в соответствующих комбинациях для окрашивания мононуклеарных клеток для определения частот клеточных линий, выделенных из крови и ректальной биопсии, с акцентом на линии, синтезирующие IL-17 и IFN-α.MAb, приобретенные у BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния), включали Alexa700-anti-CD3 (клон SP34-2), FITC-anti-CD8 (клон SK1 и клон RPA-T8), PerCP или Pac Blue anti-CD4 (клон L200 ), FITC-анти-CD14 (клон M5E2), PerCP-Cy5.5-анти-CD16 (клон 3G8), APC-Cy7-анти-CD20 (клон 2H7), PE-Cy7-анти-CD56 (клон NCAM16.2 ), APC-анти-CD123 (клон 7G3), PerCP-Cy5.5-анти-HLA-DR (клон L243), PE / APC-анти-CD11c (клон S-HCL3) и Alexa700-анти-TNF-α ( клон MAb11). MAb, приобретенное у Beckman Coulter (Brea, CA), включало PE-анти-NKG2a (клон Z199), mAb Alexa647-anti-IL-17A (клон eBio64DEC17) было приобретено у eBioscience (Сан-Диего, Калифорния) и mAb APC- анти-IFN-α (клон LT27-295) и PE / APC-анти-CD25 (клон 4E3) были приобретены у Miltenyi (Auburn, CA).

Определение частоты клеток, продуцирующих IL-17A, с помощью PBMC и мононуклеарных клеток из ректальной биопсии

Не менее 5 × 10 ⁵ мононуклеарных клеток, выделенных из ректальной биопсии, и 1 × 10 ⁶ PBMC в полной среде RPMI1640 были помещены в отдельную лунку 24-луночного планшета и стимулированы 25 нг / мл форбол-12-миристата. -13-ацетат (PMA) и 1 мкг / мл иономицина в присутствии 5 мкг / мл брефельдина A в течение 12 часов. После периода инкубации клетки промывали и окрашивали маркером Live / Dead (LIVE / DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits, Invitrogen).Затем клетки окрашивали панелью маркеров клеточной поверхности в концентрациях, рекомендованных коммерческим поставщиком. Затем клетки фиксировали и повышали проницаемость с помощью раствора BD CytoFix / CytoPerm ™ (BD Bioscience). Клетки промывали один раз буфером BD Perm / Wash ™ (BD Bioscience), а затем инкубировали с анти-IL-17A при 4 ° C в течение 30 минут. Окрашенные клетки промывали, ресуспендировали в 1% параформальдегиде в PBS и хранили при 4 ° C и анализировали с помощью полихроматической проточной цитометрии с использованием проточного цитометра B-D LSR-II (B-D Immunocytometry, Mountain View, CA).Частоты клеток CD4 ⁺ -Th27, CD8 ⁺ -Tc17 и CD3 ^—, CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ синтезирующих IL-17 (NK-17) клеток определяли на основе частот Клетки, синтезирующие IL-17, в закрытой популяции с общим количеством клеток CD4 ⁺ , CD8 ⁺ и CD3 ^—, CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ клеток, соответственно, как показано на фиг. S2. В случае мононуклеарных клеток, выделенных из ректальной биопсии, мы не могли использовать процедуру, описанную Ривзом и др. (29), потому что гранулы ингибируют активацию клеток in vitro.Поэтому мы выразили частоты клеток, синтезирующих IL-17, на основе частот родительского клеточного клона. Таким образом, частоты CD4 ⁺ -Th27 ⁺ клеток были определены как процент от общего количества CD4 ⁺ Т-клеток, и данные для первого и второго описаны на каждом рисунке, который показывает данные для клеток из колоректального тракта. биопсия тканей. Стратегия стробирования была в основном идентична той, что использовалась для PBMC (см. Рис. S2). Обозначение # на оси Y для каждого рисунка означает абсолютное количество клеток, рассчитанное на основе общего анализа крови аликвоты того же образца.

Определение частоты продуцирования IFN-α и TNF-α pDC в PBMC и мононуклеарных клетках из ректальной биопсии

Один миллион мононуклеарных клеток, выделенных из ректальной биопсии и РВМС, суспендировали в 1 мл полной среды RPMI 1640 и инкубировали с 3 мкг / мл агониста TLR7 / 8 R-848 в присутствии 5 мкг / мл брефельдина А в течение 12 часов. . После периода инкубации клетки промывали и окрашивали маркером «живой / мертвый», как описано выше. Чтобы идентифицировать популяцию pDC, клетки окрашивали поверхность анти-CD14, анти-CD123, анти-HLA-DR, анти-CD20 и анти-CD3.После промывки окрашенные клетки фиксировали, повышали проницаемость и окрашивали либо анти-IFN-α, либо анти-TNF-α при 4 ° C в течение 30 минут. Окрашенные клетки промывали и ресуспендировали в 1% параформальдегиде в PBS и хранили при 4 ° C до анализа с использованием стандартной проточной цитометрии. Аликвоты мононуклеарных клеток из тканей колоректальной биопсии также окрашивали на маркеры клеточной поверхности и внутриклеточную экспрессию IFN-α параллельно без инкубации с агонистом TLR7 / 8 в попытках определить частоты pDC, которые конститутивно экспрессировали IFN-α. .

Сбор данных и анализ данных проточной цитометрии

были проанализированы на BD FACS LSRII (BD Immunocytometry Systems), а полученные данные проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Настройка компенсации BD FACS LSRII была установлена ​​после получения неокрашенных и одноцветных контрольных образцов и вычисления матрицы компенсации. Данные не менее 100 000 событий были получены для анализа клеток, продуцирующих IL-17, и не менее 300 000 (в 90% случаев 500 000) событий были получены для анализа pDC, продуцирующих IFN-α и TNF-α.

Измерения генов, стимулированных интерфероном (ISG)

Одним из ранее задокументированных результатов заражения SIV является способность вируса стимулировать синтез различных ISG. Пытаясь определить относительные уровни ISG, синтезируемых тканями желудочно-кишечного тракта различных групп животных в этом исследовании, мы выбрали мониторинг уровней 2,5-олигоаденилатсинтетазы (OAS) и белка устойчивости к миксовирусу A (MxA) и для справки — ген домашнего хозяйства GAPDH.Анализируемые образцы состояли из мононуклеарных клеток колоректальной биопсии, полученных от животных до и на 7, 14, 21, 28 и 56 дни от 6 неинфицированных животных, 5 классифицированных как EC, 8 как LVL, 9 как IVL и 10 как HVL. животные. Анализ был выполнен в основном так, как описано Matzinger et al [34]. РНК экстрагировали из клеток, выделенных при биопсии ткани ЖКТ, и после обработки ДНКазой, полученной с образованием кДНК. GAPDH, OAS и MxA запускали параллельно в анализе RT-PCR [35], [36], а значение CT GAPDH вычитали из значений, полученных для OAS и MxA (DCT).Значения, полученные из исходных (до инфицирования) уровней (среднее из трех значений исходной выборки) от того же животного, затем вычитали из значений, полученных после инфицирования SIV (DDCT), и предполагали, что эффективность амплификации GAPDH аналогична для ISG чистое изменение в образцах после заражения было рассчитано как 2-DDCT в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Весь статистический и графический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Непараметрический U-критерий Манна-Уитни использовался для сравнения данных между группами обезьян. Статистически значимыми считались различия с p-значением менее 0,05.

Результаты

Представленные здесь данные частично представляют образцы от 55 макак-резус (RM), которые были инфицированы внутривенно 200 TCID50 либо SIVmac239, либо SIVmac251, как описано в разделе о методах. Отдельные обезьяны в этой когорте были классифицированы как EC, обезьяны с LVL, IVL или HVL на основании постоянного мониторинга вирусной нагрузки в плазме, как указано выше.Все обезьяны подверглись сероконверсии с легко определяемыми титрами анти-SIV ELISA через 6–8 недель после заражения. В каждом из этих анализов PBMC и клетки, выделенные из образцов колоректальной биопсии от взрослых SIV-отрицательных и положительных сажистых мангабей (SM), также анализировались на те же маркеры и включались в целях сравнения. Во всех случаях данные, полученные с использованием PBMC, отражают частоту соответствующей клеточной линии (%) и абсолютные числа каждой клеточной линии (как показано на фиг. A и B). Однако в случае колоректальной биопсии, к сожалению, мы не смогли использовать технику, ранее описанную Ривзом и др. [29], для определения абсолютных чисел, потому что добавление гранул подавляло способность оптимально активировать клетки in vitro.Кроме того, использование веса биопсийного материала в качестве относительной меры оказалось ненадежным с большим разбросом из-за различий в клеточном содержании и содержании влаги. Поскольку данные колоректальной биопсии в значительной степени включают результаты по отдельным подмножествам данной клеточной линии, данные выражаются как частота подмножества (на рисунке C для всех рисунков, кроме 4, 8 и 9). и, кроме того, частоты родительских клонов клеток в том же образце (на рис.D для всех, кроме рис. 4, 8 и 9).

Заметное снижение CD4

Как видно на фиг. 1A, хотя не было разницы в частоте и абсолютном количестве клеток CD4 ⁺ Th27 в PBMC из EC по сравнению с неинфицированными макаками-резусами, наблюдались явные различия как в частоте, так и в абсолютном количестве эта линия между EC / неинфицированными и инфицированными SIV обезьянами с LVL, IVL и HVL (p <0.001). Кроме того, наблюдались различия также в% CD4 Th27 между ИВЛ и HVL (p <0,01) и, как видно на рис. 1B, абсолютные числа между LVL и IVL и IVL и HVL (p <0,05). Представляет интерес обнаружение заметного уменьшения абсолютного количества, но не частоты CD4 ⁺ клеток Th27 в PBMC от SIV-положительного SM по сравнению с SIV-отрицательным SM (p <0,001). Результаты колоректальной биопсии были по существу аналогичны различиям, полученным с PBMC (рис.1C изображает% Th27, а на фиг. 1D - частоты общего количества CD4 ⁺ Т-клеток). Таким образом, частота CD4 ⁺ клеток Th27 была заметно ниже после инфицирования SIV в LVL, IVL и HVL RM (p <0,01) по сравнению с EC / неинфицированным контролем. Эти значения необходимо оценивать в свете заметного снижения, отмеченного в частотах общих CD4 ⁺ Т-клеток у животных LVL, IVL и HVL, которые снизились до 2–3% (рис. 1D), что подчеркивает значительное снижение IL-17 синтезирует CD4 ⁺ Т-клетки в тканях ЖКТ.Кроме того, наблюдалось также значительное снижение частоты общих CD4 ⁺ Т-клеток в тканях колоректальной биопсии из SIV-положительных SM по сравнению с SIV-отрицательными SM (p <0,05).

Рисунок 1. Анализ клеток Th27 ⁺ в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от зараженных SIV нечеловеческих приматов.

Частоты (%) и абсолютные числа (#) CD4 ⁺ клеток Th27 в PBMC и колоректальных биопсиях групп неинфицированных (Uninf) и инфицированных SIV макак-резус, классифицированных как элитные контролеры (EC), с уровнями в плазме низкой вирусной нагрузки (LVL), средней вирусной нагрузки (IVL) и высокой вирусной нагрузки (HVL) на левой панели.Правые панели отражают одни и те же измерения у серонегативных (отрицательных) и серопозитивных (положительных) сажистых мангабей на SIV, проанализированных параллельно. A) Отражает данные о% CD4 ⁺ Th27 клеток в PBMC B) абсолютном количестве CD4 ⁺ Th27 клеток C)% CD4 ⁺ Th27 клеток в тканях колоректальной биопсии и D)% CD4 ⁺ Т-клетки в той же аликвоте биоптатов. Статистически значимые данные отражены количеством звездочек с p <0,02 (*). р <0.05 (**), p <0,01 (***), p <0,001 (****) и p <0,0001 (*****) для всех цифр.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g001

Снижение CD8

Хотя не было значительных различий в частотах Tc17 в PBMC RM в различных группах (рис. 2A), увеличение абсолютного количества общих CD8 ⁺ T-клеток привело к увеличению абсолютного количества Клетки Tc17, особенно у обезьян с HVL (p <0.05) (рис. 2В). Интересно, что было очевидно значительное снижение как частоты (p <0,02), так и абсолютного числа (p <0,05) клеток Tc17 в PBMC SM после инфицирования. В отличие от PBMC, наблюдалось заметное снижение Tc17-клеток в колоректальных тканях RM, инфицированных SIV, и уровень снижения коррелировал с уровнями VL в плазме (рис. 2C), хотя общее количество CD8 ⁺ T клетки либо не изменились, либо показали небольшое увеличение как RM, так и SM после инфицирования (рис.2D).

Рисунок 2. Анализ клеток Tc17 в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от зараженных SIV нечеловеческих приматов.

Номенклатура идентична фиг. 1, за исключением того, что данные отражают значения для клеток CD8 ⁺ IL-17 (Tc-17).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g002

Отмеченные изменения в частотах и ​​абсолютном количестве клеток NK-17

Из изученных подмножеств клеток частота и абсолютное количество клеток NK-17 ⁺ показали наиболее значимое чистое изменение с заметным увеличением EC и LVL по сравнению с неинфицированными RM (p <0.001) и заметное снижение RM с IVL и HVL по сравнению с EC RM (p <0,0001), как показано на фиг. 3A и 3B. Уменьшение этого подмножества представляющих интерес клеток также было отмечено в PBMC SM после инфицирования SIV как по частотам (p <0,0001), так и по абсолютным числам (p <0,01). Эти клетки NK-17 ⁺ также заметно снизились по частоте в тканях колоректальной биопсии из LVL, IVL и HVL, инфицированных SIV RM, но не EC, по сравнению с неинфицированными животными, хотя частота NKG2a ⁺ NK-клеток увеличилась. предполагая, что это снижение в клетках NK-17 ⁺ является избирательным и более серьезным (рис.3C и D). Также наблюдалось небольшое снижение частот NK-17 ⁺ клеток в SIV-инфицированных SM по сравнению с SIV-отрицательными SM, хотя частоты общих NK-клеток не изменились. Таким образом, хотя уменьшение этого клеточного клона, наблюдаемое в RM с LVL, IVL и HVL, по-видимому, связано с уровнями VL, значимость заметного увеличения RM EC явно не связана с виремией, но, вероятно, из-за уровней цитокинов, высвобождаемых в виде следствие эффективного вирусного контроля.Точно так же заметное уменьшение этой клеточной линии в PBMC SIV-положительных SM по сравнению с SIV-отрицательными SM трудно объяснить, и также возможно, что все эти изменения могут быть вторичными по отношению к различиям в паттернах хоминга этих клеток после инфицирования.

Рисунок 3. Анализ клеток NK-17 в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от зараженных SIV нечеловеческих приматов.

Номенклатура идентична фиг. 1, за исключением того, что данные отражают значения для клеток CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ (NK).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g003

При анализе частот всех линий, синтезирующих IL-17, было отмечено, что значительное количество синтезирующих IL-17 клеток экспрессировали CD3 ^— CD8 ⁺ NKG2a ^{— фенотип} (который включает клетки NKp44 ⁺ ). Эта подгруппа была отмечена только в тканях биопсии ЖКТ и поэтому была проанализирована. Еще раз, когда произошло увеличение частот и абсолютного числа этой линии в EC (p <0.02) по сравнению с неинфицированным RM (фиг. 4A и B), наблюдалось уменьшение этой линии и фракции, которая синтезировала IL-17 в LVL, IVL и HVL обезьян, а также уровень снижения, связанный с VL в плазме. Никакого различия в частотах родительских CD3 ^— клеток CD8 ⁺ NKG2a ^— и / или фракции IL-17 ⁺ этой клеточной линии не было отмечено в образцах от SM после инфицирования SIV.

Рисунок 4. Анализ новых клеточных субпопуляций IL-17 ⁺ в колоректальных биопсиях от нечеловеческих приматов, инфицированных SIV.

Частоты (%) CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ^— и CD3 ⁺ , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ субнаборов клеток в тканях колоректальной биопсии из групп неинфицированные макаки-резус, инфицированные SIV макаки-резус, классифицированные как элитные контролеры (EC), с LVL, IVL и HVL на левой панели. Правые панели отражают данные о серонегативных (отрицательных) и инфицированных SIV серопозитивных (положительных) сажистых грибах. A) Частоты CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ^— подмножества NK-клеток, которые представляют собой IL-17 ⁺ B) Частоты родительских CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ^— клеток из того же экземпляра.C) Частоты CD3 ⁺ , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ , которые являются IL-17 ⁺ D) Частоты родительских CD3 ⁺ , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ клеток из того же образец.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g004

Увеличение частот новой подгруппы CD3

В ходе исследований колоректальной биопсии было интересно найти другое подмножество клеток NKG2a ⁺ с уникальным фенотипом, некоторые из которых также синтезировали IL-17, который не обнаруживался в обнаруживаемых уровнях в соответствующих PBMC.Как видно на фиг. 4D, по-видимому, наблюдалось значительное увеличение частоты клеток NKG2a ⁺ , которые экспрессировали как CD3, так и CD8, выделенные из колоректальной биопсии из каждой подгруппы инфицированных SIV (EC, LVL и HVL). ) макаки-резус. Статистической разницы между ИВЛ и LVL не было. Интересным было открытие, что, хотя наблюдается увеличение этой подгруппы в тканях из EC и LVL, частоты, которые синтезируют IL-17, заметно снижаются у всех инфицированных SIV макак-резус (рис.4С). Никаких обнаружимых изменений не было отмечено в этой подгруппе от SM после SIV (фиг. 4C и D), но важно отметить, что значительное количество синтезирует IL-17 (фиг. 4D). Функциональный анализ in vitro аликвоты этой высокоочищенной популяции этой субпопуляции из неинфицированных RM с использованием проточной цитометрии показал, что, хотя эта субпопуляция из макак-резус не показала детектируемой цитотоксичности NK-клеток, эта субпопуляция из SIV-отрицательных SM показала легко обнаруживаемую цитотоксичность, идентифицирующую значительную различие в функциях между RM и SM (данные не показаны).Более подробное изучение этого подмножества продолжается.

Снижение Treg CD4

Был значительный интерес к роли Treg, в частности, к их роли в тканях, обогащенных клетками с провоспалительным потенциалом, такими как клетки Th27 и Th2, с точки зрения того, что эти Treg обеспечивают доминирующую негативную регуляторную функцию для минимизации местной тканевой патологии. . Таким образом, эта клеточная линия была изучена на тех же образцах от этих обезьян.Как видно на фиг. 5A и 5B, хотя наблюдается увеличение частот и, в целом, абсолютных количеств Treg CD4 ⁺ в PBMC из EC RM, наблюдается уменьшение Treg CD4 ⁺ в PBMC. образцы из LVL, IVL и HVL RM во время хронической инфекции SIV по сравнению с неинфицированным контролем. Никаких различий в этой подгруппе не было отмечено в образцах PBMC от СМ, инфицированных SIV, по сравнению с СМ отрицательными с SIV. Когда были исследованы образцы ткани колоректальной биопсии, в то время как EC и LVL RM показали вариабельное, но статистически незначимое снижение, IVL и HVL явно показали значительное снижение (рис.5С). Это снижение, однако, должно быть проанализировано в контексте снижения общего количества CD4 ⁺ Т-клеток, которое также значительно уменьшилось в LVL, IVL и HVL RM (рис. 5D). Отношения между Treg и клетками Th27 обсуждаются ниже. Treg CD4 ⁺ в колоректальной биопсии из SM не изменились по частоте, хотя, по-видимому, произошло значительное снижение общего количества T-клеток CD4 ⁺ (p <0,05).

Фигура 5. Анализ Treg-клеток CD4 ⁺ в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от нечеловеческих приматов, инфицированных SIV.

Номенклатура идентична фиг. 1, за исключением того, что данные отражают значения для CD4 ⁺ Treg. Обратите внимание, что D) отражает частоту общего количества CD4 ⁺ Т-клеток в том же образце.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g005

Повышение частоты Treg CD8

Как видно на рис. 6A и 6B, хотя наблюдалось увеличение как частоты, так и абсолютного количества Treg CD8 ⁺ в PBMC из LVL, IVL и HVL RM по сравнению со значениями в неинфицированном RM, было гораздо больше заметное увеличение Treg CD8 ⁺ в PBMC от EC RM после инфицирования SIV (p <0.001). Не было отмечено увеличения частоты и абсолютного количества Treg CD8 ⁺ в образцах PBMC от SM после инфицирования SIV.

Фигура 6. Анализ CD8-Tregs клеток в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от зараженных SIV нечеловеческих приматов.

Номенклатура идентична рис. 1, за исключением того, что данные отражают значения для CD8 ⁺ Treg.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g006

Подобно значениям, наблюдаемым в PBMC, также наблюдается увеличение частоты Treg CD8 ⁺ в коло-ректальных биопсиях из EC, LVL , IVL и HVL RM после инфицирования SIV по сравнению со значениями для неинфицированных RM (p <0.0001), однако относительное увеличение, наблюдаемое в тканях биопсии, казалось, было упорядочено как отражение вирусной нагрузки в плазме (см. Рис. 6C). Также было увеличение частоты общих CD8 ⁺ Т-клеток (фиг. 6D), но, за исключением животных с HVL, по сравнению с неинфицированными животными, эти различия не были статистически значимыми. Кроме того, хотя наблюдалось статистически значимое увеличение частот общих CD8 ⁺ Т-клеток в СМ, инфицированных SIV, не было значительного изменения частоты CD8 ⁺ Treg.

Реципрокное снижение по сравнению с увеличением количества плазмоцитоидных дендритных клеток (pDC) в PBMC и колоректальных тканях после заражения SIV RM, но не SM

Одним из наиболее поразительных результатов этого исследования является очень последовательное относительное снижение частоты и абсолютного количества циркулирующих уровней пДК (рис. 7A и B) и повышение в соответствующих тканях колоректальной биопсии из того же RM после SIV. инфекция (рис. 7C). Таким образом, тогда как частоты pDC в PBMC от EC и LVL обезьян снизились по сравнению с неинфицированным контрольным RM (p <0.01), дальнейшее снижение также было отмечено, связанное с IVL (p <0,001) и HVL (p <0,0001) по сравнению со значениями для неинфицированного RM (рис. 7A). Эти различия были также отражены в абсолютном количестве pDC в PBMC (фиг. 7B). Небольшое, но достоверное снижение абсолютных количеств pDC в PBMC было также отмечено у SIV-положительных SM (p <0,05). В отличие от уменьшения PBMC, ткани колоректальной биопсии из RM показали заметное увеличение частот pDC с увеличением VL в плазме, за исключением EC обезьян (рис.7C). Колоректальная биопсия из SM, однако, не показала значительных изменений, хотя значения были довольно вариабельными, а числа были значительно ниже как для SIV-отрицательного, так и для положительного SM по сравнению с RM (обратите внимание на изменение оси Y, левая панель по сравнению с правой. панель).

Рисунок 7. Анализ pDC в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от зараженных SIV нечеловеческих приматов.

Частоты и абсолютное количество CD123 ⁺ в закрытой популяции клеток HLA-DR ⁺ Lin ^— (pDC) в PBMC и тканях колоректальной биопсии той же группы животных, как показано на рис. .1. A) Частоты pDC в PBMC B) Абсолютное количество pDC в PBMC C) Частоты pDC в тканях колоректальной биопсии от одних и тех же животных.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g007

Различия в характере изменений частот конститутивных по сравнению с индуцированными уровнями синтезирующей IFN-α pDC в PBMC и колоректальной биопсии

Ряд интересных наборов данных появился, когда pDC из PBMC и колоректальной биопсии были исследованы на частоты, которые конститутивно экспрессировали IFN-α по сравнению с индуцированными уровнями IFN-α как в RM, так и в SM после инфекции SIV.Таким образом, как видно на фиг. 8A, явно наблюдалось увеличение частоты конститутивно экспрессируемого IFN-α ⁺ pDC в PBMC из EC (p <0,02) и снижение конститутивно экспрессируемого IFN-α pDC в PBMC из HVL RM (p <0,05) по сравнению с неинфицированным контрольным RM. Увеличение частоты конститутивно экспрессируемого IFN-α ⁺ pDC было также отмечено в PBMC от SIV-положительного SM по сравнению с SIV-отрицательным SM (p <0,05). Когда были исследованы индуцированные уровни IFN-α, самые высокие уровни были отмечены в PBMC из RM с LVL, которые были значительно выше, чем даже EC RM (p <0.05). Оказалось, что существует резистентность к индукции IFN-α с увеличением вирусной нагрузки, как это наблюдается у обезьян HVL (p <0,001), что подтверждает мнение о том, что повышенные уровни IFN-α, по крайней мере, в крови, не являются основанием для хронического иммунитета. активация, как считалось ранее. Индуцированные частоты IFN-α ⁺ pDC варьировали в образцах PBMC из SM, и поэтому данные не были значимыми.

Данные о частотах конститутивных и / или индуцированных количеств IFN-α ⁺ pDC в клетках из колоректальной биопсии дали относительно простую картину (см.рис.8Б). Таким образом, наблюдалось небольшое, но достоверное увеличение частот конститутивного IFN-α ⁺ pDC, связанное с прогрессивным увеличением VL в плазме, по сравнению с неинфицированным RM (p <0,02). Напротив, хотя наблюдалось значительное снижение частот индуцированных уровней IFN-α ⁺ pDC в образцах из EC RM (p <0,02) и LVL RM (p <0,05), наблюдалось заметное увеличение частот индуцировал IFN-α ⁺ pDC в образцах из ИВЛ (p <0,05) и HVL RM (p <0.01). Не было значительных различий в конститутивных и индуцированных частотах IFN-α ⁺ pDC в колоректальных тканях из SIV ⁺ и SIV-SM. Эти данные, по-видимому, предполагают, что увеличение вирусной нагрузки вызывает состояние рефрактерности к синтезу IFN-α в pDC из PBMC (рефрактерность также была отмечена в pDC лимфатических узлов после инфицирования SIV) и что HVL в RM ассоциирован с повышенным переносом pDC в колоректальные ткани, которые постоянно синтезируют более высокие уровни IFN-α и обладают способностью хронически синтезировать увеличивающиеся уровни индуцированного IFN-α.Таким образом, устойчивые высокие уровни пДК IFN-α ⁺ , по-видимому, связаны с HVL и плохим прогнозом.

Фигура 8. Анализ клеток pDC IFN-α ⁺ в PBMC и соответствующие колоректальные биопсии от нечеловеческих приматов, инфицированных SIV.

Частоты пДК, синтезирующих IFN-α, в PBMC (A) и тканях колоректальной биопсии (B) той же группы животных, что изображена на рис. 1. Пустые столбцы отражают частоты pDC, которые конститутивно экспрессируют IFN. -α, а темные столбцы отражают частоты pDC, которые индуцируются для экспрессии IFN-α.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g008

Проспективное исследование pDC в PBMC и соответствующих тканях колоректальной биопсии из RM во время острой инфекции SIV

Приведенные выше интересные данные о заметных изменениях в pDC побудили нас провести проспективное исследование, направленное на изучение изменений в частотах pDC и частотах pDC, которые синтезируют IFN-α и TNF-α в PBMC и колоректальной биопсии. от той же обезьяны и проанализируйте данные ретроспективно после того, как обезьяны достигли заданного значения вирусной нагрузки и хронической стадии, чтобы их можно было классифицировать как EC, LVL, IVL и HVL RM.Общее количество клеток, которые можно было получить из пулов тканей биопсии, ограничивало количество маркеров, которые можно было проанализировать. Как видно на рис. 9A, наблюдается резкое увеличение частоты pDC в PBMC на очень ранней стадии после инфицирования SIV (в течение 2–4 дней после инфицирования) у всех обезьян, которая постепенно снижается либо до исходного уровня (EC и LVL), либо ниже. исходные уровни (ИВЛ и HVL). Интересным было обнаружение того факта, что, хотя наблюдается увеличение частот pDC в колоректальных тканях после инфицирования SIV, паттерны ЭК по сравнению с LVL, IVL и HVL различны (рис.9Б). Таким образом, в то время как на 2–4-й день EC наблюдается увеличение pDC, к 7-му дню p.i. это увеличение было еще более сильным. который затем быстро снижается до исходного уровня. В случае LVL и IVL уровень увеличения достигает пика на 2–4 дни, а затем сохраняется в дальнейшем. Однако в случае HVL RM, по-видимому, наблюдается постепенное увеличение частот pDC, но пик уровней приходится на 21 день p.i. (p <0,001), а затем снижается, но уровни остаются выше, чем EC, LVL и IVL RM. Таким образом, в то время как временное увеличение частоты pDC связано с EC, устойчивый высокий перенос pDC в колоректальные ткани связан с HVL.Когда была исследована фракция pDC в PBMC, которая может индуцировать синтез IFN-α, снова выявились отчетливые паттерны (фиг. 9C). Таким образом, хотя имело место временное увеличение pDC IFN-α ⁺ в PBMC из EC, увеличение также происходило в PBMC из LVL, но этот повышенный потенциал сохранялся в этой группе животных LVL. С другой стороны, увеличение частоты IFN-α ⁺ pDC в PBMC сопровождалось постепенным снижением как в IVL, так и в HVL RM с более выраженным снижением в группе HVL.Эти данные предполагают, что низкие уровни виремии должны поддерживать повышенный потенциал pDC в PBMC для синтеза IFN-α, но с увеличением VL эта функция нарушается, даже если наблюдается заметное уменьшение количества pDC в HVL RM во время хронической инфекции (рис. . 7А). Когда были исследованы индуцированные частоты IFN-α, синтезирующие pDC из тканей колоректальной биопсии, оказалось, что было резкое увеличение уровней на 2–4 день (p <0,05) и на 7 день p.i. (p <0,001) в образцах от обезьян EC, которые впоследствии вернулись к исходным уровням (рис.9D). Хотя были некоторые изменения в частотах синтезирующих IFN-α pDC в образцах от обезьян LVL и IVL, образцы от обезьян HVL показали выраженное устойчивое увеличение в период острой инфекции вплоть до 56-го дня, но важно отметить, что представляет собой заметное снижение количества пДК, синтезирующих IFN-α, во время поздней хронической инфекции (> 36 недель после инфицирования). Эти данные предполагают, что временное увеличение пДК IFN-α ⁺ связано с EC, но устойчивое повышение во время острой инфекции связано с HVL, который впоследствии становится невосприимчивым к синтезу IFN-α.

Фигура 9. Кинетика общих и IFN-α ⁺ пДК в PBMC и колоректальных биопсиях от инфицированных SIV макак.

Кинетика частот A) pDC в PBMC, B) pDC в соответствующих колоректальных биоптатах (C) частоты pDC, показанные на (A), которые были IFN-α ⁺ в PBMC и D) частоты pDC, которые были показаны в (B), которые были IFN-α-положительными в тканях колоректальной биопсии. Данные были получены на когорте макак-резус до (незараженных) и после внутривенного инфицирования 1000 TCID50 SIVmac239, собранных на 2–4, 7, 14, 21, 28 и 56 дни.я. Обезьяны были ретроспективно классифицированы как EC, LVL, IVL и HVL после того, как они достигли заданного значения вирусной нагрузки и достигли хронической стадии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.g009

Заметное увеличение пДК, синтезирующих TNF-α, является ценным маркером для инфицированных SIV RM с IVL и HVL, а отсутствие TNF-α

Когда были исследованы частоты синтезирующих TNF-α pDC в PBMC и тканях колоректальной биопсии, уровни в PBMC не показали каких-либо значительных изменений в различных группах обезьян (данные не показаны).Однако в случае клеток, полученных из ткани колоректальной биопсии, наблюдалась четкая связь постепенного увеличения пДК TNF-α ⁺ селективно у обезьян с ИВЛ и еще более выраженного увеличения у обезьян с ВЛП (см. Дополнительный рисунок). S3), но не у обезьян, классифицируемых как EC или обезьяны с LVL. Интересно, что это увеличение ИВЛ было отмечено к 14 дню (р <0,05), с дальнейшим увеличением к дню 28 (р <0,01) и 56 дню (р <0,001). Увеличение количества обезьян HVL было замечено в образцах после 21 дня (p <0.05), 28-й и 56-й день (p <0,0001). Эти данные предполагают, что отсутствие увеличения пДК TNF-α ⁺ связано с ЭК и что появление пДК, синтезирующих TNF-α, связано с увеличением вирусной нагрузки, как это наблюдается у обезьян с ИВЛ до ВПЧ.

Обсуждение

Взаимодействие между вирусами, вирусными геномами, вирусными белками и различными промежуточными продуктами вирусной репликации с рецепторами распознавания патогенов хозяина (PRR) является инициирующим событием, которое играет детерминированную роль в качестве и количестве ответа хозяина, который вырабатывается против вирусных патогенов.Такие начальные взаимодействия приводят к синтезу и высвобождению широкого спектра медиаторов, включая цитокины, хемокины и интерфероны (IFN), а также к модуляции различных молекул клеточной поверхности, экспрессируемых взаимодействующими клетками [37] — [39]. В физиологических условиях это созвездие клеток должно ассимилировать и интегрировать такие разнообразные сигнальные события во время острой инфекции и интегрировать биологический диалог, происходящий на клеточной мембране и происходящий внутри клетки, в эффективную согласованную функцию, которая находится в правильной временной и пространственной среде для достичь биологически функционального состояния, которое приносит пользу хозяину и поддерживает гомеостаз.Нерегулируемая передача сигналов через любой из этих путей во время острой инфекции является нежелательным исходом для хозяина и приводит к таким событиям, как «цитокиновые бури», сопровождающиеся повреждением, способствующим воспалению, повреждением тканей и в некоторых случаях летальным для хозяина [40], [41]. Таким образом, чистые результаты таких взаимодействий во время острой инфекции определяются балансом между провоспалительными и противовоспалительными механизмами, который закладывает основу для физиологического генерирования приобретенных иммунных ответов, потенциально способных вывести вирус.С другой стороны, нарушение регуляции этих событий приводит к неэффективным приобретенным иммунным ответам и последствиям болезни для хозяина. Детальное изучение этого взаимодействия между эффекторными клетками и молекулами врожденного и приобретенного иммунитета при ВИЧ / SIV-инфекции отсутствует. Целью представленных здесь исследований было начать систематическое устранение этого пробела в наших знаниях.

В настоящем исследовании доступность большой когорты макак-резусов, инфицированных SIVmac239 или 251, которые демонстрировали широкий диапазон вирусных нагрузок во время хронической инфекции, использовалась для изучения профиля линий клеток, синтезирующих IL-17, включая CD4, CD8 и подгруппы. NK-клеток и других клеточных линий, таких как Treg CD4 ⁺ и CD8 ⁺ , которые, как предполагается, оказывают влияние на синтезирующие IL-17 клетки, особенно в тканях желудочно-кишечного тракта.Наконец, исследования также включали определение частот pDC, которые синтезируют IFN-α.

Важность цитокина IL-17 и клеточных линий, которые синтезируют IL-17, в частности клеток Th27, была подчеркнута из-за их способности синтезировать IL-22 и, таким образом, их роли в поддержании целостности ЖКТ и его потенциальной роли в патогенезе. инфекций ВИЧ / SIV как у людей, так и у приматов [22], [24], [25], [28]. В целом, результаты представленных здесь исследований показывают, что наблюдается заметное снижение как частоты, так и абсолютного числа IL-17, синтезирующих CD4 ⁺ клеток Th27 в крови и колоректальных тканях, связанное с увеличением вирусной нагрузки (рис.1A и B). Интересным было открытие, что также наблюдается уменьшение абсолютного количества этой же линии в крови мангабей SIV ⁺ с тенденцией также в тканях GI (рис. 1 C и D). На первый взгляд эти данные предполагают, что это снижение связано с виремией, а не с заболеванием, хотя можно было бы спорить о том, актуальны ли результаты, полученные на мангабе, для макак-резусов. Интересно отметить, что в отличие от данных по CD4-Th27, абсолютное количество клеток Tc-17 ⁺ в крови увеличилось (рис.2B), но уменьшилась частота в колоректальных тканях (рис. 2C). Эти данные предполагают, что механизмы, связанные с регуляцией синтезирующих IL-17 клеток в крови по сравнению с тканями желудочно-кишечного тракта, должны отличаться качественно и / или количественно. Точно так же, хотя частоты NK-17 также снизились в крови и тканях желудочно-кишечного тракта макак-резус, что коррелировало с ВН в плазме, абсолютные количества в крови и, следовательно, в тканях ЖКТ фактически увеличились (рис. 3). Недавнее открытие, что IL-21, синтезирующее CD4 ⁺ , CD95 ⁺ , CCR6 ^— Т-клетки памяти CD4 ⁺ , выполняет такую ​​регуляторную функцию [42], побудило нас проанализировать частоты этого клеточного клона в подмножество тех же обезьян.Действительно, инфекция SIV приводит к истощению этой подгруппы (данные не показаны), которая хорошо коррелирует с частотами CD4-Th27 в крови и тканях GI, но не с Tc17 ⁺ и NK-17 ⁺ клеток в крови. Этот дисбаланс в соотношении Th27 и Tc17 согласуется с предыдущими сообщениями Kader et al [43]. Также важно отметить, что инфекция SIV также приводит к снижению частот и абсолютных количеств Tc17 ⁺ в мангабее, хотя количество Т-клеток IL-21 ⁺ CD4 ⁺ не изменилось у этого вида.Эти данные предполагают, что могут существовать различные механизмы регуляции IL-17, синтезирующего CD4, по сравнению с клетками Tc17 и клетками NK-17, что является предметом текущего исследования. Повышенное абсолютное количество клеток NK-17 ⁺ в крови обезьян с увеличением VL в плазме также оказалось высокоактивированным, что позволяет предположить, что такие клетки могут пытаться регулировать функцию антивирусных T-эффекторных клеток CD8 ⁺ , как описано в другом месте. [44] способствуют развитию хронической инфекции.

В ходе анализа частот клеток, синтезирующих IL-17, было отмечено, что существуют дополнительные подмножества линии NK-клеток, уникально присутствующие в тканях GI, которые экспрессируют IL-17, что побудило нас включить эти линии клеток в наш анализ. .Сюда входят клетки CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ^— , которые, скорее всего, включают клетки NKp44 ⁺ [30] и ранее не описанные CD3 ⁺ , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ клеточные линии. Было отмечено заметное снижение частоты обоих этих клеточных линий (фиг. 4B-D), и фракции которых были индуцированы для экспрессии IL-17 (фиг. 4A и C). Находятся ли эти 2 клеточных линии под регуляцией синтезирующих CD4 ⁺ IL-21 клеток, в настоящее время неясно, но согласуется с потерей этой субпопуляции в тканях GI, как описано выше.Эти данные также свидетельствуют о пластичности роли IL-17, синтезирующих клеточные клоны [45] — [47]. Кроме того, важно отметить, что не все клетки Tc17 экспрессируют гранзимы и / или киллерную функцию, но с высокой частотой экспрессируют коингибиторную молекулу CTLA-4 [27], и поэтому изменения в их уровнях необходимо интерпретировать с помощью этих функциональных атрибутов. в уме.

Связующая и взаимодействующая роль CD4-Tregs с клоном клеток Th27, в частности, была подчеркнута в ряде исследований и недавно рассмотрена [48], [49].По общему мнению, эти CD4-Treg подавляют противовирусный Т-клеточный ответ, но не активацию Т-клеток. Более свежие данные показывают, что ген-мишень для FoxP3, отличительного фактора транскрипции, который идентифицирует nTregs, является промоторной областью IL-22 [50], что позволяет предположить, что активация CD4-Tregs приводит к подавлению синтеза IL-22 клетками Th27, таким образом снижается воспалительная роль клеток Th27 ⁺ . Что трудно понять в этом контексте, так это то, что, хотя IL-22 необходим для поддержания целостности ткани GI, повышенная функция Treg может привести к снижению индуцированной Th27 продукции IL-22.Очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы лучше определить взаимодействие, и, возможно, именно кинетика, с помощью которой проявляется такое взаимодействие, определяет результаты. В исследованиях, представленных здесь, данные очень согласуются с данными, обобщенными Hartigan-O’Connor et al [48]. Таким образом, явно наблюдается значительное увеличение частоты и абсолютного количества CD4-Treg (рис. 5A-D) как в крови, так и в колоректальных тканях у макак-резусов ЭК, но заметное снижение, связанное с увеличением VL у остальных.Несколько иная картина выявила анализ CD8-Treg. Таким образом, наблюдалось увеличение как частоты, так и абсолютного количества CD8-Treg в крови EC, LVL, IVL и HVL по сравнению с неинфицированными контрольными животными (фиг. 6A и B). Увеличение было наиболее заметным в ЕС. Эти данные в основном согласуются с данными, опубликованными ранее Nigam et al [51], и предполагают, что повышенные уровни связаны с повышенной вирусной нагрузкой и плохим прогнозом. Однако повышенные уровни, наблюдаемые у обезьян ЭК, особенно в крови, требуют устранения.Хотя Treg CD8 ^— на самом деле были описаны давно и придуманы супрессорные Т-клетки, данные накапливались, так как эта иммунная регуляция на самом деле довольно сложна и имеет множество разновидностей. Таким образом, существуют природные Tregs (nTregs), Treg, продуцирующие IL-10 (Tr1), TGF-β, продуцирующие Treg (Th4), CD8-Treg, а в последнее время даже NK-T regs и NK-regs [52] — [54] . Описанные здесь CD8-Treg являются классическими FoxP3, экспрессирующими регуляторные Т-клетки CD8 ⁺ , которые также экспрессируют CTLA-4 и CD39.Сходны ли CD8-Treg в ЭК функционально с CD8-Treg у обезьян с HVL, в настоящее время неясно, хотя предварительные исследования показывают, что они не экспрессируют гранзимы и, скорее всего, не являются цитолитическими. Текущие исследования показывают, что микроматричные профили CD8-Tregs из ЕС сильно отличаются от Treg-клеток CD8 ⁺ от HVL обезьян и в настоящее время изучаются. Эти данные подчеркивают недавно рассмотренную концепцию раздвоения личности таких регуляторных Т-клеток [55].

Возрастает интерес к роли pDC как играющих важную роль в определении исходов инфекции ВИЧ / SIV [26], [33], [56] — [60]. Эта концепция была основана на открытии того факта, что pDC являются основным источником IFN-α [61], который опосредует сильные противовирусные эффекты, особенно во время острой инфекции, и, следовательно, важность этой клеточной линии. Наша лаборатория была первой, кто задокументировал обнаружение быстрой мобилизации (в течение 2–4 дней p.i.) пДК в крови с последующим их накоплением в тканях ЖКТ инфицированных SIV макак-резус [26].Однако детального изучения его взаимосвязи с плазменной ВН не проводилось. Таким образом, было высказано мнение, что изучение этой клеточной линии и ее роли в оси IL-17 / Treg / pDC важно. Как отмечалось выше, существует очень хорошая взаимосвязь между уровнями виремии в плазме и частотами и абсолютным количеством pDC как в крови, так и в колоректальных тканях (рис. 7 A – C). Таким образом, увеличение VL привело к снижению уровней pDC в крови, но представляет интерес повышение уровней в соответствующих колоректальных тканях.Затем мы определили частоты конститутивных и индуцированных частот IFN-α, синтезирующих pDC. Наиболее ярким отмеченным изменением были высокие частоты синтезирующих IFN-α pDC в LVL по сравнению с HVL, при этом IVL показывала промежуточные уровни в крови (рис. 8A) и наоборот — в колоректальных тканях (рис. 8B). Эти данные, по-видимому, подразумевают, что, хотя количество pDC в HVL уменьшается в крови, их способность синтезировать IFN-α еще больше снижается, но те, которые попадают в кишечник, увеличиваются как в количестве, так и в их способности синтезировать IFN-α, что предполагает что устойчивые IFN-α-чувствительные pDC имеют плохой прогноз, что является важным открытием, имеющим значение для вакцин, которые разрабатываются для индукции сильной активации pDC, особенно во время острой инфекции.Это дополнительно подтверждается открытиями, что более низкие частоты pDC и относительно более низкие уровни IFN-α, по-видимому, связаны с EC и LVL. В целом, эти данные, по-видимому, предполагают, что хорошо регулируемый подход к мобилизации небольшого количества pDC может быть полезен для хозяина.

Повышенная важность pDC, задокументированная в ряде исследований ВИЧ-1-инфицированных EC [59], включая их дифференциальную роль в естественных устойчивых к заболеванию SIV и неприродных восприимчивых к заболеваниям хозяевах [26], побудила нас начать более подробное проспективное исследование КПК.Что представляло интерес, так это обнаружение заметного увеличения количества pDC в крови всех животных независимо от возможной VL (фиг. 9A). Таким образом, эта повышенная мобилизация должна быть общей функцией вирусной инфекции и не предсказывать будущую ВН в плазме. В этом контексте представляла интерес разница в профиле LVL по сравнению с HVL. Таким образом, в то время как увеличение наблюдается в начале периода p.i. сохраняется на том же уровне в LVL, наблюдается дальнейшее заметное увеличение HVL, достигающее пика на 21 день p.я. и повышенная частота сохраняется на уровне, наблюдаемом на 14-й день у этих обезьян HVL. Эти данные, по-видимому, предполагают, что повышенные уровни pDC в тканях GI имеют прогностическую ценность, которая должна привести к HVL. Первоначальное повышение с последующей стабилизацией было явно оптимальным, поскольку привело к ЭК. Однако устойчивое умеренное увеличение было связано с более высоким ВН. В конце концов, однако, pDC даже в HVL становятся невосприимчивыми к индукции IFN-α во время поздней хронической инфекции, что свидетельствует об отсутствии роли IFN-α в хронической иммунной активации, вопрос, который рассматривался в нескольких предыдущих исследованиях. [62] — [64].Причины этих различий в настоящее время не ясны, хотя важная роль IFN-α была документально подтверждена при инфицировании ВИЧ-1 [37], [65] — [67]. Кроме того, для дальнейшего изучения этой проблемы мы также проанализировали кровь и колоректальную ткань на предмет выявления некоторых ISG. Что было интересно, так это открытие, что как в крови, так и в колоректальных тканях первоначальное повышение с последующим заметным снижением уровней этих ISG было связано с ЭК и LVL, но высокие устойчивые уровни ISG на уровне мРНК были связаны с IVL и HVL (Рисунок S4).Эти данные предполагают, что гены, стимулирующие интерферон, кроме IFN-α, могут вносить вклад в хроническую иммунную активацию, что является предметом текущего исследования.

Таким образом, с акцентом на параметры в тканях желудочно-кишечного тракта, снижение ряда линий синтезирующих IL-17 клеток, включая CD4 ⁺ Т-клетки (Th27), клетки Tc17, клетки NK-17 и CD3 ^{— /} CD8 ⁺ / NKG2a ^— Подмножество NK-клеток в сочетании со снижением частот CD4-Treg, но повышенным количеством CD8-Treg и pDC с устойчивым синтезом IFN-α pDC (включая повышенные уровни устойчивых ISG) предсказывает HVL и плохое клинический исход.Появление увеличения частот пДК, синтезирующих TNF-α, в конце периода острой инфекции, также имеет плохой прогноз. Напротив, поддержание высоких уровней клонов синтезирующих IL-17 клеток в сочетании с повышенными уровнями Treg CD4 ⁺ , но поддержание нормальной частоты CD8-Treg и более низкие уровни pDC с умеренной способностью синтезировать IFN-α и ниже уровни ISG и синтезирующих TNF-α pDC связаны с ЭК и в некоторой степени с LVL.Таким образом, для разработки вакцины эти парадигмы должны обеспечить важную начальную основу и тестируются в составе вакцин-кандидатов в нашем учреждении и в других местах. Из этих исследований также ясно, что pDC становятся невосприимчивыми к индуцированному TLR синтезу IFN-α, несмотря на устойчивое увеличение ISG, что дает наводящие на размышления доказательства того, что гены, отличные от тех, которые кодируют IFN-α, вероятно, способствуют хронической иммунной активации. Наконец, хотя изначально соотношение CD4 ⁺ Tregs: Th27 может быть критическим, как это видно на EC и LVL, вскоре после этого кажется, что вирус истощает Th27 и, таким образом, CD4 ⁺ Tregs не может проявлять свою функцию, поскольку их мишени Истощаются ли Th27 под действием прямого вируса.После этого именно Treg CD8 ⁺ , по-видимому, играют главную отрицательную роль, особенно в тканях GI. Эти данные предоставляют ряд новых мишеней для иммуноопосредованной модуляции.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Сводка результатов вирусной нагрузки плазмы при инфекции SIV макак-резус. Классификация 103 макак-резус, инфицированных внутривенно либо SIVmac239, либо 251, на основе вирусной нагрузки в плазме после достижения заданного значения VL и во время хронической инфекции.Они были классифицированы как обезьяны с> 10 ⁶ вирусных копий / мл (HVL), с 250000 до 1 миллиона вирусных копий / мл и с 10000 до 250000 вирусных копий / мл (IVL), с <10000 вирусных копий. / мл (LVL) и с неопределяемой вирусной нагрузкой (EC).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.s001

(TIFF)

Рисунок S2.

Репрезентативный профиль стратегий стробирования, используемых для определения частот и абсолютных чисел A) CD4 ⁺ -Th27, CD8 ⁺ Tc17, CD3 ^— , CD8 ⁺ , NKG2a ⁺ -NK17 клеток и B) IFN-α, синтезирующий дендритный плазмацитоид в PBMC макак-резус.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.s002

(TIFF)

Рисунок S3.

Кинетика пДК TNF-α ⁺ в PBMC и колоректальных биопсиях от инфицированных SIV макак. Частоты плазмоцитоидных дендритных клеток (pDC) из тканей колоректальной биопсии, которые экспрессировали TNF-α из когорты макак-резус, инфицированных внутривенно 1000 TCID50 SIVmac239. Образцы от тех же обезьян собирали до (день 0) и на 7, 14, 21, 28 и 56 дни.я. Общее количество pDC в этих образцах отражено в тексте под рис. 9В.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.s003

(TIFF)

Рисунок S4.

Кинетика экспрессии генов, стимулирующих интерферон (ISG) в колоректальной биопсии макак, инфицированных SIV. Кинетика экспрессии (A) 2,5-олигоаденилатсинтетазы (OAS) и (B) белка устойчивости к миксовирусу A (MxA) на уровне мРНК в аликвотах колоректальных биопсий когорты макак-резусов до (Незараженных) и после внутривенной инфекции 1000 TCID50 SIVmac239.Данные отражают кратное изменение уровней мРНК в образцах, собранных на 7, 14, 21, 56 и 84 p.i. как указано в разделе «Методы».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061264.s004

(TIFF)

Благодарности

Мы признательны за выдающуюся помощь, оказанную нам ветеринарным персоналом Национального центра приматов Йеркса, без которого эта работа не была бы выполнена. Мы особенно признательны госпоже.Стефани Энерт и г-на Криса Содера за их усердие в выполнении изложенных протоколов и информирование нас о здоровье животных.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AAA KP. Проведены эксперименты: LK NO AEM DML. Проанализированы данные: AAA FV. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AAA. Написал статью: AAA LK KP.

Список литературы

1. 1. Дикс С.Г. (2011) ВИЧ-инфекция, воспаление, иммунное старение и старение.Анну Рев Мед 62: 141–155.
2. 2. Гутьеррес Ф., Падилья С., Масия М., Ирибаррен Дж. А., Морено С. и др. (2008) Характеристики пациентов и клинические последствия субоптимального прироста Т-лимфоцитов CD4 после 1 года успешной антиретровирусной терапии. Curr HIV Res 6: 100–107.
3. 3. Hunt PW, Martin JN, Sinclair E, Bredt B, Hagos E, et al. (2003) Активация Т-клеток связана с более низким приростом CD4 ⁺ Т-клеток у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, с устойчивым вирусным подавлением во время антиретровирусной терапии.J Infect Dis 187: 1534–1543.
4. 4. Ледерман М.М., Калабрезе Л., Фундербург Н.Т., Клагетт Б., Медвик К. и др. (2011) Иммунологическая неудача, несмотря на подавляющую антиретровирусную терапию, связана с активацией и обновлением CD4-клеток памяти. J Infect Dis 204: 1217–1226.
5. 5. Маркетти Дж., Беллистри Дж. М., Борги Э., Тинкати С., Феррамоска С. и др. (2008) Микробная транслокация связана с устойчивым нарушением восстановления CD4 ⁺ Т-клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих длительную высокоактивную антиретровирусную терапию.СПИД 22: 2035–2038.
6. 6. Никастри Э., Кьези А., Анджелетти С., Сармати Л., Пальмизано Л. и др. (2005) Клинический результат после 4-летнего наблюдения за ВИЧ-серопозитивными субъектами с неполным вирусологическим или иммунологическим ответом на ВААРТ. J Med Virol 76: 153–160.
7. 7. Тан Р., Вестфол А.О., Уиллиг Дж. Х., Мугаверо М.Дж., Сааг М.С. и др. (2008) Клинические результаты ВИЧ-инфицированных пациентов, ранее не получавших антиретровирусные препараты, с дискордантными иммунологическими и вирусологическими ответами на высокоактивную антиретровирусную терапию.J Acquir Immune Defic Syndr 47: 553–558.
8. 8. Carrington M, Alter G (2012) Врожденный иммунный контроль ВИЧ. Cold Spring Harb Perspect Med 2: a007070.
9. 9. Ивасаки А. (2012) Врожденное иммунное распознавание ВИЧ-1. Иммунитет 37: 389–398.
10. 10. Ploquin MJ, Jacquelin B, Jochems SP, Barre-Sinoussi F, Muller-Trutwin MC (2012) Врожденный иммунитет в борьбе с ВИЧ / СПИДом: последние достижения и открытые вопросы. СПИД 26: 1269–1279.
11. 11.Bostik P, Takahashi Y, Mayne AE, Ansari AA (2010) Врожденные иммунные естественные клетки-киллеры и их роль в инфицировании ВИЧ и SIV. ВИЧ Ther 4: 483–504.
12. 12. Бренчли Дж. М., Шакер Т. В., Рафф Л. Э., Прайс Д. А., Тейлор Дж. Х. и др. (2004) CD4 ⁺ Истощение Т-лимфоцитов на всех стадиях ВИЧ-инфекции происходит преимущественно в желудочно-кишечном тракте. J Exp Med 200: 749–759.
13. 13. Chan JK, Greene WC (2012) Динамические роли NF-kappaB в патогенезе ретровирусов HTLV-I и ВИЧ-1.Immunol Rev 246: 286–310.
14. 14. Данхэм Р.М., Черваси Б., Бренчли Дж. М., Альбрехт Н., Вайнтроб А. и др. (2008) Экспрессия CD127 и CD25 определяет субпопуляции CD4 ⁺ Т-клеток, которые дифференциально истощаются во время ВИЧ-инфекции. J Immunol 180: 5582–5592.
15. 15. Heise C, Miller CJ, Lackner A, Dandekar S (1994) Первичная инфекция лимфоидной ткани кишечника, вызванная вирусом острого обезьяньего иммунодефицита, связана с желудочно-кишечной дисфункцией. J Infect Dis 169: 1116–1120.
16. 16. Кухрт Д., Фейт С.А., Леоне А., Роханкедкар М., Содора Д.Л. и др. (2010) Доказательства ранней дисрегуляции В-клеток при инфицировании вирусом иммунодефицита обезьян: быстрое истощение субпопуляций наивных В-клеток и В-клеток памяти с отсроченным восстановлением популяции наивных В-клеток. J Virol 84: 2466–2476.
17. 17. Mattapallil JJ, Smit-McBride Z, Dailey P, Dandekar S (1999) Активированные CD4 (+) Т-хелперные клетки памяти повторно заселяют кишечник на ранней стадии после антиретровирусной терапии макак-резус, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян, но демонстрируют пониженный потенциал для выработки интерлейкина-2 .J Virol 73: 6661–6669.
18. 18. Моанна А., Данхэм Р., Пайардини М., Сильвестри Г. (2005) CD4 ⁺ Истощение Т-клеток при ВИЧ-инфекции: убито дружественным огнем? Curr HIV / AIDS Rep 2: 16–23.
19. 19. Qin S, Sui Y, Soloff AC, Junecko BA, Kirschner DE, et al. (2008) Опосредованная хемокинами и цитокинами потеря регуляторных Т-клеток в лимфатических узлах во время инфекции, вызванной патогенным вирусом иммунодефицита обезьян. J Immunol 180: 5530–5536.
20. 20. Розенцвейг М., Коннол М., Форанд-Барабаш А., Тремблей М.П., ​​Джонсон Р.П. и др.(2000) Механизмы, связанные с апоптозом тимоцитов, вызванным вирусом иммунодефицита обезьян. J Immunol 165: 3461–3468.
21. 21. Цзэн М., Хаазе А.Т., Шакер Т.В. (2012) Структура лимфоидной ткани и ВИЧ-1-инфекция: жизнь или смерть для Т-клеток. Тенденции Immunol 33: 306–314.
22. 22. Бренчли Дж. М., Пайардини М., Нокс К. С., Ашер А. И., Черваси Б. и др. (2008) Дифференциальное истощение Th27 CD4 Т-клеток при патогенных и непатогенных лентивирусных инфекциях. Кровь 112: 2826–2835.
23. 23. Кампильо-Хименес Л., Кумонт М.К., Фэй М., Каред Х., Монсо В. и др. (2010) Прогрессирование СПИДа связано с появлением клеток, продуцирующих IL-17, вскоре после заражения вирусом иммунодефицита обезьян. J Immunol 184: 984–992.
24. 24. Чеккинато В., Триндади С.Дж., Лоуренс А., Херауд Дж. М., Бренчли Дж. М. и др. (2008) Измененный баланс между клетками Th27 и Th2 на участках слизистой оболочки предсказывает прогрессирование СПИДа у макак, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян.Иммунол слизистой оболочки 1: 279–288.
25. 25. Фавр Д., Ледерер С., Канвар Б., Ма З. М., Пролл С. и др. (2009) Критическая потеря баланса между популяциями Th27 и Т-регуляторных клеток при патогенной инфекции SIV. PLoS Pathog 5: e1000295.
26. 26. Ква С., Каннанганат С., Нигам П., Сиддики М., Шетти Р. Д. и др. (2011) Плазмацитоидные дендритные клетки рекрутируются в толстую кишку и вносят свой вклад в активацию иммунной системы во время патогенной инфекции SIV у макак-резусов. Кровь 118: 2763–2773.
27. 27. Нигам П., Ква С., Велу В., Амара Р. Р. (2011) Потеря Т-клеток CD8, продуцирующих IL-17, во время поздней хронической стадии инфекции, вызванной патогенным вирусом иммунодефицита обезьян. J Immunol 186: 745–753.
28. 28. Раффателлу М., Сантос Р.Л., Верховен Д.Е., Джордж М.Д., Уилсон Р.П. и др. (2008) Дефицит интерлейкина-17 слизистой оболочки, вызванный вирусом обезьяньего иммунодефицита, способствует распространению сальмонелл из кишечника. Нат Мед 14: 421–428.
29. 29. Ривз Р.К., Эванс Т.И., Гиллис Дж., Вонг Ф.Е., Коннол М. и др.(2011) Количественная оценка мононуклеарных клеток слизистой оболочки в тканях с помощью анализа полихроматической проточной цитометрии на основе флуоресцентных шариков. J Immunol Methods 367: 95–98.
30. 30. Ривз Р.К., Раджакумар П.А., Эванс Т.И., Коннол М., Гиллис Дж. И др. (2011) Воспаление кишечника и индоламиндеоксигеназа ингибируют выработку IL-17 и способствуют цитотоксическому потенциалу NKp44 ⁺ NK-клеток слизистой оболочки во время инфекции SIV. Кровь 118: 3321–3330.
31. 31. Wonderlich ER, Kader M, Wijewardana V, Barratt-Boyes SM (2011) Анализ роли дендритных клеток в инфицировании вирусом иммунодефицита обезьян и СПИДе.Immunol Res 50: 228–234.
32. 32. Xu H, Wang X, Liu DX, Moroney-Rasmussen T., Lackner AA, et al. (2012) Врожденные лимфоидные клетки, продуцирующие IL-17, ограничены тканями слизистой оболочки и истощены у SIV-инфицированных макак. Mucosal Immunol 5: 658–669.
33. 33. Ривз Р.К., Эванс Т.И., Гиллис Дж., Вонг Ф.Е., Канг Г. и др. (2012) Инфекция SIV вызывает накопление плазматических дендритных клеток в слизистой оболочке кишечника. J Infect Dis 206: 1462–1468.
34. 34. Matzinger SR, Carroll TD, Fritts L, McChesney MB, Miller CJ (2011) Экзогенное введение IFN-альфа снижает репликацию вируса гриппа A в нижних дыхательных путях макак-резусов.PLoS One 6: e29255.
35. 35. Ансари А.А., Рейманн К.А., Мейн А.Э., Такахаши Ю., Стивенсон С.Т. и др. (2011) Блокирование интегрина alpha4beta7 в кишечнике во время острой инфекции приводит к снижению вирусной нагрузки в плазме и тканях желудочно-кишечного тракта у макак-резусов, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян. J Immunol 186: 1044–1059.
36. 36. Виллинджер Ф., Хант Д., Мейн А., Вучетич М., Финдли Х. и др. (1993) Качественные и количественные исследования цитокинов, синтезируемых и секретируемых мононуклеарными клетками периферической крови приматов, кроме человека.Цитокин 5: 469–479.
37. 37. Pitha PM (2011) Врожденный противовирусный ответ: роль в инфекции ВИЧ-1. Вирусы 3: 1179–1203.
38. 38. Virgin HW, Wherry EJ, Ahmed R (2009) Новое определение хронической вирусной инфекции. Ячейка 138: 30–50.
39. 39. Wack A, Openshaw P, O’Garra A (2011) Вклад цитокинов в патологию и защиту при вирусной инфекции. Curr Opin Virol 1: 184–195.
40. 40. Rouse BT, Sehrawat S (2010) Иммунитет и иммунопатология к вирусам: что решает исход? Nat Rev Immunol 10: 514–526.
41. 41. Walsh KB, Teijaro JR, Rosen H, Oldstone MB (2011) Преодоление шторма: использование передачи сигналов рецептора сфингозин-1-фосфата для улучшения цитокинового шторма, вызванного вирусом гриппа. Immunol Res 51: 15–25.
42. 42. Micci L, Cervasi B, Ende ZS, Iriele RI, Reyes-Aviles E, et al. (2012) Нехватка Т-клеток CD4 ⁺ , продуцирующих IL-21, связана с истощением клеток Th27 при инфекции SIV у макак-резусов. Кровь 120: 3925–3935.
43. 43.Kader M, Bixler S, Piatak M, Lifson J, Mattapallil JJ (2009) Антиретровирусная терапия не может восстановить серьезный дисбаланс Th-17: Tc-17, наблюдаемый в периферической крови во время заражения вирусом иммунодефицита обезьян. J Med Primatol 38 Дополнение 132–38.
44. 44. Ланг PA, Lang KS, Xu HC, Grusdat M, Parish IA, et al. (2012) Активация естественных клеток-киллеров усиливает иммунную патологию и способствует развитию хронической инфекции, ограничивая Т-клеточный иммунитет CD8 ⁺ . Proc Natl Acad Sci U S A 109: 1210–1215.
45. 45. Йе Дж, Ливергуд Р.С., Пэн Дж. (2012) Роль и регуляция человеческих клеток Th27 в опухолевом иммунитете. Am J Pathol.
46. 46. Йен Х. Р., Харрис Т. Дж., Вада С., Гроссо Дж. Ф., Гетнет Д. и др. (2009) Tc17 CD8 T-клетки: функциональная пластичность и разнообразие субпопуляций. J Immunol 183: 7161–7168.
47. 47. Канаи Т., Миками Ю., Суджино Т., Хисамацу Т., Хиби Т. и др. (2012) RORgammat-зависимые клетки, продуцирующие IL-17A, в патогенезе воспаления кишечника Immunol. Слизистой оболочки.5: 240–247.
48. 48. Hartigan-O’Connor DJ, Hirao LA, McCune JM, Dandekar S (2011) Клетки Th27 и регуляторные Т-клетки в элитном контроле над ВИЧ и SIV. Curr Opin HIV AIDS 6: 221–227.
49. 49. Канвар Б., Фавр Д., МакКьюн Дж. М. (2010) Th27 и регуляторные Т-клетки: последствия для патогенеза СПИДа. Curr Opin HIV AIDS 5: 151–157.
50. 50. Джерон А., Хансен В., Эверт Ф., Буэр Дж., Гефферс Р. и др. (2012) Анализ ChIP-on-chip идентифицирует IL-22 как прямой ген-мишень эктопически экспрессируемого фактора транскрипции FOXP3 в человеческих Т-клетках.BMC Genomics 13: 705.
51. 51. Нигам П., Велу В., Каннанганат С., Ченнаредди Л., Ква С. и др. (2010) Экспансия FOXP3 ⁺ T-клеток CD8 с подавляющим потенциалом в слизистой оболочке толстой кишки после инфекции, вызванной патогенным вирусом иммунодефицита обезьян, коррелирует со снижением противовирусного Т-клеточного ответа и вирусным контролем. J Immunol 184: 1690–1701.
52. 52. Gol-Ara M, Jadidi-Niaragh F, Sadria R, Azizi G, Mirshafiey A (2012) Роль различных подмножеств регуляторных Т-клеток в иммунопатогенезе ревматоидного артрита.Артрит 2012: 805875.
53. 53. Goubier A, Vocanson M, Macari C, Poyet G, Herbelin A и др .. (2012) Инвариантные NKT-клетки подавляют CD8 ( ⁺ ) T-клеточный аллергический контактный дерматит независимо от регуляторных CD4 (+) T-клеток. J Invest Dermatol.
54. 54. Сайто С., Сиодзаки А., Сасаки Ю., Накашима А., Шима Т. и др. (2007) Регуляторные Т-клетки и регуляторные естественные киллеры (NK) играют важную роль в толерантности плода и матери. Семин Иммунопатол 29: 115–122.
55. 55. Chevalier MF, Weiss L (2012) Расщепление личности регуляторных Т-клеток при ВИЧ-инфекции. Кровь.
56. 56. Brown KN, Wijewardana V, Liu X, Barratt-Boyes SM (2009) Быстрый приток и гибель плазматических дендритных клеток в лимфатических узлах опосредуют истощение при острой инфекции вируса обезьяньего иммунодефицита. PLoS Pathog 5: e1000413.
57. 57. Диоп О.М., Плокин М.Дж., Мортара Л., Фэй А., Жаклен Б. и др. (2008) Динамика плазмоцитоидных дендритных клеток и продукция альфа-интерферона во время инфицирования вирусом иммунодефицита обезьян с непатогенным исходом.J Virol 82: 5145–5152.
58. 58. Фицджеральд-Бокарсли П., Якобс Э. С. (2010) Плазмацитоидные дендритные клетки при ВИЧ-инфекции: достижение тонкого баланса. J Leukoc Biol 87: 609–620.
59. 59. Machmach K, Leal M, Gras C, Viciana P, Genebat M и др. (2012) Плазмацитоидные дендритные клетки снижают продукцию ВИЧ у элитных контролеров. J Virol 86: 4245–4252.
60. 60. О’Брайен М., Манчес О., Бхардвадж Н. (2013) Плазмацитоидные дендритные клетки при ВИЧ-инфекции.Adv Exp Med Biol 762: 71–107.
61. 61. Инь З., Дай Дж., Дэн Дж., Шейх Ф., Наталья М. и др. (2012) IFN типа III продуцируются плазматическими дендритными клетками человека и стимулируют их. J Immunol 189: 2735–2745.
62. 62. Benlahrech A, Patterson S (2011) Инфекция ВИЧ-1 и индукция интерферона альфа в плазматических дендритных клетках. Curr Opin HIV AIDS 6: 373–378.
63. 63. Донхаузер Н., Притчет К., Хельм М., Харрер Т., Шустер П. и др. (2012) Хроническая активация иммунной системы при ВИЧ-1-инфекции способствует снижению продукции интерферона альфа за счет усиления взаимодействия лигандов CD40: CD40.PLoS One 7: e33925.
64. 64. Вандерфорд Т.Х., Слихтер С., Роджерс К.А., Лоусон Б.О., Обеде Р. и др. (2012) Обработка зараженных SIV сажистых растений мангабея агонистом IFN типа I приводит к снижению репликации вируса без индукции гипериммунной активации. Кровь 119: 5750–5757.
65. 65. Gougeon ML, Herbeuval JP (2012) IFN-альфа и TRAIL: обоюдоострый меч при болезни ВИЧ-1? Exp Cell Res 318: 1260–1268.
66. 66. Hughes R, Towers G, Noursadeghi M (2012) Врожденные иммунные реакции интерферона на инфекцию вируса иммунодефицита человека-1.Преподобный Мед Вирол 22: 257–266.
67. 67. Леви Дж. А., Каушик С., Тек Ф., Патель М., Фудзимура С. Г. и др. (2012) Число плазматических дендритных клеток и ответы на толл-подобные рецепторы 7 и 9 агонистов различаются у лиц, инфицированных ВИЧ-1, в зависимости от клинического состояния. Ретровирусы AIDS Res Hum 7: 7.

Elements Оптимизация налогообложения Малые и средние экономические агенты во время кризиса

Автор

• Negoescu Gheorghe

  (Университет Овидия Констанца, Румыния)

• Mihalcea Lucean

  (Университет Дунареа-де-Жос, Галац, Румыния)

Abstract

В Румынии существует высокий уровень налогообложения, который резко снижает оставшиеся денежные средства, доступные экономическим агентам в условиях, когда краткосрочные и долгосрочные ссуды предоставляются под процентные ставки в два-три раза выше, чем в Европе, США и Япония.Неуплата долга перед государством приведет к доступу (проценты, пени и штрафы), значительная отсрочка на один год может привести к двойной пошлине. В этих условиях малые предприятия вынуждены искать личные сбережения (надеюсь) для погашения дебиторской задолженности в IFN с невыгодными процентными условиями или с ростовщиками преступного мира. В этих условиях неудивительно, что количество корпоративных банкротов увеличилось. В нашей попытке ответить на PFA альтернативное трудоустройство или как форма налоговой оптимизации.

Рекомендуемая ссылка

Скачать полный текст от издателя

Самые популярные товары

1. Георге НЕГОЕСКУ и Риана Ирен РАДУ, 2012. « Новые взгляды на роль знаний предпринимателей в экономическом развитии одного еврорегиона », Риск в современной экономике, Галацкий университет «Дунареа де Жос», факультет экономики и делового администрирования, страницы 51-56.
2. Люкеан МИХАЛЧЕЯ, 2012 г. « Антикризисное управление: вызовы или возможности для государственных и частных менеджеров перед лицом экономической катастрофы », Риск в современной экономике, Галацкий университет «Дунареа де Жос», факультет экономики и делового администрирования, страницы 429-432.
3. Георгий Негоеску, 2012. «Сравнительный анализ , основа некоторых жизнеспособных решений в предпринимательстве », EuroEconomica, Danubius University of Galati, выпуск 2 (31), страницы 127-135, май.
4. Люкеан МИХАЛЧЕЯ, 2012 г. « Антикризисное управление: вызовы или возможности для государственных и частных менеджеров перед лицом экономической катастрофы », EuroEconomica, Danubius University of Galati, выпуск 1 (31), страницы 41-45, февраль.
5. Георгий НЕГОЭСКУ, 2014. « Влияние привлечения капитала на финансовые показатели компании », Риск в современной экономике, Галацкий университет «Дунареа де Жос», факультет экономики и делового администрирования, страницы 358–362.

Исправления

Все материалы на этом сайте предоставлены соответствующими издателями и авторами. Вы можете помочь исправить ошибки и упущения. При запросе исправления укажите идентификатор этого элемента: RePEc: ddj: fserec: y: 2015: p: 314-319 . См. Общую информацию о том, как исправить материал в RePEc.

По техническим вопросам, касающимся этого элемента, или для исправления его авторов, заголовка, аннотации, библиографической информации или информации для загрузки, обращайтесь:.Общие контактные данные провайдера: https://edirc.repec.org/data/fegalro.html .

Если вы создали этот элемент и еще не зарегистрированы в RePEc, мы рекомендуем вам сделать это здесь. Это позволяет привязать ваш профиль к этому элементу. Это также позволяет вам принимать потенциальные ссылки на этот элемент, в отношении которых мы не уверены.

Если CitEc распознал библиографическую ссылку, но не связал с ней элемент в RePEc, вы можете помочь с этой формой .

Если вам известно об отсутствующих элементах, цитирующих этот элемент, вы можете помочь нам создать эти ссылки, добавив соответствующие ссылки таким же образом, как указано выше, для каждого элемента ссылки. Если вы являетесь зарегистрированным автором этого элемента, вы также можете проверить вкладку «Цитаты» в своем профиле службы авторов RePEc, поскольку там могут быть некоторые цитаты, ожидающие подтверждения.

По техническим вопросам, касающимся этого элемента, или для исправления его авторов, названия, аннотации, библиографической информации или информации для загрузки, обращайтесь: Гианина Михай (адрес электронной почты указан ниже).Общие контактные данные провайдера: https://edirc.repec.org/data/fegalro.html .

Обратите внимание, что исправления могут занять пару недель, чтобы отфильтровать различные сервисы RePEc.

Anonghost 51 — Приветствую, граждане мира. Мы …

Приветствую вас, граждане мира.
Мы Аноним Румыния

Слишком многие из нас борются с этой какофонией обмана, которую навязывают нам наши корпоративные государственные учреждения.Мы действительно не свободны, но мы служим финансовым учреждениям, которые опутывают все грани цивилизации своей паутиной. Деньги, которые власть имущие используют для пропаганды вашего рабства, — всего лишь иллюзия. Они создают вашу ценность, вашу фибру существа, и большинство из нас остаются на исцелении. Это нужно изменить. Банки, взыскатели долгов, IFN, учреждения, предлагающие токсичные предложения и имеющие токсичные кредиты, незаконно заключили контракты. Вы можете не осознавать масштабы этого явления, тысячи жертв совершили эти экономические убийства, но каждую неделю появляются десятки решений судов об отмене принудительных казней, чтобы выяснить оскорбительный характер договорных положений (проценты, комиссионные) мы будем следить за ними и анализировать происходящую ситуацию, они должны быть срочно устранены из Румынии!

Кормим свои машины.Мы их машины. Они пожирают плоды нашего труда. У нас появилась идея, и эта идея вспыхнула, как лесной пожар, в сердцах и умах человечества во всем мире. Они пытались убить эту идею, но теперь мы стали сильнее, чем когда-либо. Мы — антибиотик, излечивающий болезнь антигуманного рака.

Мы не проповедуем с высоких пьедесталов и не говорим людям, что делать, потому что мы — это вы. Мы все должны работать сообща.

Люди считают, что у нас нет ответов или решений, но у нас, технических специалистов, есть.Большинство из нас верят в правительство с открытым исходным кодом, подкрепленное ресурсной экономикой на планетарном уровне. Если операционная система компьютера дает сбой, ее заменяют. Мы рассматриваем правительства как глобальные операционные системы, полные ошибок и отчетов о сбоях. Нажатие выключателя и перезагрузка просто не помогут понять, насколько испорчены эти глобальные операционные системы. Переформатирование и создание правительства с открытыми исходными кодами, основанного на гуманитарных принципах, обеспечит равенство для всех.

Мы — один вид, и нам нужно развиваться как таковые.Нет причин, по которым немногие избранные могут приобрести так много, в то время как большинство страдает, когда у нас есть технологии, которые позволили бы каждому мужчине, женщине и ребенку на Земле жить лучше, чем 1%.

Более четырехсот лет назад один великий гражданин пожелал навсегда оставить пятое ноября в нашей памяти. Его надеждой было напомнить миру об этой справедливости. Справедливость и свобода — это больше, чем слова — это перспективы. Так что, если вы ничего не видели, если преступления этого правительства остаются вам неизвестными, то я предлагаю вам позволить пятому ноября пройти без опознавательных знаков.Но если вы видите то, что вижу я, если вы чувствуете то же, что и я, и если вы будете искать, как я ищу … тогда я прошу вас встать рядом друг с другом в один год, начиная с 5 ноября 2019 года, у ворот каждого здания суда каждый город ТРЕБУЕТ наших прав!

Станьте с нами в маске или без нее.

5 ноября, идите вместе с нами. Носите лицо или скройте свою личность маской. Мы нуждаемся в вас. Мы это ты. Они, те, кто отвечает за вашу страну, те, кто отправляет бедняков умирать в чужих странах из-за ресурсов, из-за недовольства, из-за расизма и потому, что они хотят этого; они те, кто никогда не изменится.Мы, люди, не хотим смерти, мы не хотим их войн на истощение. Мы хотим мира, мы хотим, чтобы наши дети пережили старение и имели будущее. Нам нужно бороться за свое будущее.

Марш пройдет по городам мира. Как эти места определяются на странице планировщика мероприятий Anonymous Legion Romania на мероприятии в Facebook. Так, например, если вы хотите присоединиться к Маршу миллионов масок в Бухаресте, Румыния,
, вам необходимо присоединиться к местному мероприятию на Facebook.Тем не менее, можно отправить сообщение организаторам мероприятия MMM с указанием вашего местоположения и количества людей, которые появятся, чтобы их направили на карту.

Мы анонимны.
Мы — Легион.
United as ONE.